【正文】 Time PCR Detection System Corbett Research公司 Rotorgene202 Rotorgene3000 、 Rotorgene6000 MJ Research公司 Opticon、 MJ Mini Cycler、 MiniOpticon Stratagene公司 Mx4000174。 TaKaRa公司可以提供 最佳引物的設(shè)計(jì)合成服務(wù) Real Time 進(jìn)入 SYBR Green I 時(shí)代 保證以上條件，使用 SYBR Green I將 會更加便宜，更為方便，并擁有良 好的特異性。 以前對 PCR引物的選擇、 PCR試劑的優(yōu)化 經(jīng)驗(yàn)不足， Probe法較為廣用。 Q R 核糖核苷酸 Cycling Probe法 生物秀 — 專心做生物！ 熱變性 酶切 延伸 Cycling Probe法基本原理 退火 SYBR Green I法 vs Probe法 SYBR Green I 法 ◆優(yōu)點(diǎn)：價(jià)格便宜、使用方便、 無需合成特異性探針。 Real Time PCR 原理 生物秀 — 專心做生物！ 在 PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)，并實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光信號積累的整個(gè) PCR進(jìn)程，最后通過已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知濃度的樣品進(jìn)行定量分析。（ Real Time PCR） 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR介紹 生物秀 — 專心做生物！ 主要內(nèi)容 Real Time PCR 基礎(chǔ)知識 Real Time PCR 實(shí)驗(yàn)方法 Real Time PCR 解析方法 Real Time PCR 應(yīng)用實(shí)例 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR 基礎(chǔ)知識 Real Time PCR 的用途及原理 Real Time PCR 檢測方法 Real Time PCR 檢測系統(tǒng) 差異顯示結(jié)果驗(yàn)證 定性分析 絕對定量 相對定量 病毒和病原菌檢測 基因芯片結(jié)果驗(yàn)證 siRNA效果確認(rèn) mRNA表達(dá)量分析 Real Time PCR 用途 操作簡單，無需電泳，檢測快速，降低污染幾率， 適用于大量樣品檢測，檢測靈敏度高； 可以在寬廣范圍內(nèi)進(jìn)行準(zhǔn)確定量。 ( C代表 Cycle， t代表 threshold） Ct值概念 閾值：在擴(kuò)增曲線的指數(shù)增長區(qū)域內(nèi)適當(dāng)位置上 設(shè)定的熒光檢出界限。 TaqMan Probe法作用機(jī)理 TaqMan Probe 法作用機(jī)理示意圖 熱變性 引物和探針與模板退火 延伸反應(yīng) 探針 報(bào)告基團(tuán) 淬滅基團(tuán) 探針 DNA聚合酶 引物 R R R R 生物秀 — 專心做生物！ Cycling probe為一寡核苷酸， 5’端標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán) (Reporter)， 3’端標(biāo)記一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)(Quencher)，寡核苷酸為 DNA/RNA雜合體。 ◆缺點(diǎn)：需要設(shè)計(jì)特異性探針，成本高、有時(shí)設(shè)計(jì)困難。 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ GATC CTAG GATC CTAG 使用 SYBR Green I 進(jìn)行定量 PCR 的 Key Point Primer： 設(shè)計(jì)合適引物，防止非特異性擴(kuò)增，是使用 SYBR Green I 進(jìn)行定量 PCR 的 Key Point。 480 Cepheid公司 Smart Cycler、 Smart Cycler II、 Smart Cycler 174。 480 Rotorgene6000 MiniOpticon Mx3005PTM LINEGENE FQD66A ABI PRISM 7500 iQ5 RealTime PCR Detection System TaKaRa TP800 各公司 Real Time PCR檢測系統(tǒng)比較 儀器名稱 反應(yīng)孔數(shù) 反應(yīng)孔間 獨(dú)立性 檢出通道 升降溫速度 Tube ROX熒光 校正功能 TaKaRa TP800 96 無 25 快 Tube 無 ABI7000 96 無 4 快、慢兩種 8聯(lián)管、 專用 Cap 有 ABI7500 Fast 5 快 Light 32 無 6 快 專用毛細(xì)玻璃管 無 Light Cycler 480 96 or 384 5 快 專用板 Smart Cycler 16 (6 16 ) 有 4 快 專用、塑料＋石英 無 RotorGene 3000 36 () 72 () 無 4 慢 Tube, Tube 無 MiniOpticon 48 無 2 快 Tube 無 iQ5 RealTime PCR Detection System 96 無 5 快 Tube 無 LINEGENE FQD66A 66 無 4 快 Tube 無 Mx3000P174。通常 mRNA表達(dá)量分析最適。 Real Time PCR用引物與普通 PCR引物設(shè)計(jì)要求不同 = 對引物設(shè)計(jì)要求嚴(yán)格 普通 PCR引物 Real Time PCR引物 Real Time PCR引物及探針設(shè)計(jì) 擴(kuò)增片段大小 ★ 80150bp(盡量限制在 300bp以內(nèi) ) Primer長度 ★ 1725base GC含量 ★ 4060%(最好 4555%) Tm值 ★ ★ ★ 兩條引物的 Tm值盡量接近，引用專用軟件計(jì)算 Tm值 序列 ★ 整體上堿基不能過偏 個(gè)別部分避免 GC rich或 AT rich(特別是 3’端 ) 避免 T/C連續(xù)， A/G連續(xù) 3’末端序列 ★ 3’末端避免 GC rich或 AT rich 3’末端堿基最好為 G 或 C 3’末端堿基盡量避免為 T 互補(bǔ)性 ★ ★ ★ 引物內(nèi)部或兩條引物之間避免 3base以上的互補(bǔ)序列 引物 3’末端避免 2base以上的互補(bǔ)序列 特異性 ★ ★ ★ 使用 BLAST檢索，確認(rèn)引物特異性 RTPCR用引物 ★★ 盡量在 Exon junction上設(shè)計(jì)引物，限制基因組 DNA擴(kuò)增 Real Time PCR用引物設(shè)計(jì)原則 ★ 號表示重要程度， ★ 號越多，表示該參數(shù)越重要，設(shè)計(jì)時(shí)要優(yōu)先考慮 生物秀 — 專心做生物！ 目的基因序列獲得 好的引物 需要尋找好的參照序列 引物設(shè)計(jì) 分析序列 特異性確認(rèn) 基因組序列確認(rèn) RefSeq序列 目的基因 Real Time PCR引物及探針設(shè)計(jì) Real Time RTPCR 引物 生物秀 — 專心做生物！ （ 通過 NCBI獲得參考序列和相關(guān)情報(bào)。將質(zhì)粒梯度稀釋至 105101 copies/ul，作為標(biāo)準(zhǔn)品。 擴(kuò)增效率（ E）： , 越接近 1，越理想。通常應(yīng)用于病毒、細(xì)菌、衣原體、支原體的定量檢測及轉(zhuǎn)基因食品的檢測。 生物秀 — 專心做生物！ 熱變性 酶切 延伸 Cycling Probe法基本原理 退火 RNase H分解 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 雜合探針 雜合探針 雜合探針 PCR反應(yīng) 模板 DNA 野生型（ wild homo）為 ROX標(biāo)記，突變型（ mutant homo）為 FAM標(biāo)記。 ? 高擴(kuò)增效率 → 可以檢測低拷貝 DNA模板 。 試劑選擇的要素 生物秀 — 專心做生物！ 定量范圍寬廣 擴(kuò)增效率高， 起峰時(shí)間早 低拷貝檢測清晰 反應(yīng)特異性高， 負(fù)對照擴(kuò)增穩(wěn)定 (無非特異性擴(kuò)增 ) 間隔距離均勻 信號強(qiáng)度高 試劑選擇的要素 生物秀 — 專心做生物！ 實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目 以 λDNA （ 1fg、 10fg、 100fg、 1pg、 10pg、 100pg、 1ng） 為模板，進(jìn)行 300bp擴(kuò)增性能及擴(kuò)增特異性檢測。 使用儀器 ABI 7000 TaKaRa Perfect Real Time相關(guān)試劑與其它公司同類產(chǎn)品的比較 生物秀 — 專心做生物！ 在 ABI PRISM 7000上的比較 TaKaRa 公司 TaKaRa 公司 TaKaRa 公司 A公司 A公司 A公司 C公司 C公司 增幅效率 = 相關(guān)系數(shù) = （ Standard Curve取 7點(diǎn)） 增幅效率 = 相關(guān)系數(shù) = （ Standard Curve取 7點(diǎn)） 增幅效率 = 相關(guān)系數(shù) = （ Standard Curve取 7點(diǎn)） C公司 TaKaRa ＞ C ＞ A TaKaRa Perfect Real Time相關(guān)試劑與其它公司同類產(chǎn)品的比較 進(jìn)行 Real Time PCR TaqMan Probe探針法 Cycleave探針法檢測 (CycleavePCR) 不需要優(yōu)化反應(yīng)體系 不需要優(yōu)化反應(yīng)體系 要組成獨(dú)特反應(yīng)體系 SYBR Premix Ex Taq (Perfect Real Time) (Code RR041A/B ) CycleavePCR Core Kit (Code CY501) TaKaRa Ex Taq RPCR (Code RR031A/B ) Premix Ex Taq (Perfect Real Time) (Code RR039A/B ) 進(jìn)行 Real Time RTPCR反應(yīng) SYBR Greenl法檢測 TaqMan Probe探針法 Cycleave探針法檢測 (Cycleave RTPCR) SYBR Ex Script RTPCR Kit (Perfect Real Time) (Code RR053A ) Ex Script RTPCR Kit (Perfect Real Time) (Code RR051A ) Cycleave RTPCR Core Kit (Code CY502) One Step RTPCR One StepSYBR RTPCR Kit (Perfect Real Time) (Code RR046A/B ) One Step RTPCR Kit (Perfect Real Time) (Code RR044A/B ) 對使用 Perfect Real Time進(jìn)行 Real Time RTPCR的客戶 ,提供 primer合成服務(wù) 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋專用試劑 EASY Dilution (Code ) 探針法檢測 SYBR Greenl法檢測 探針法檢測 生物秀 — 專心做生物！ TaKaRa Perfect Real Time相關(guān)系列產(chǎn)品特點(diǎn) 適合各種 Real Time PCR裝置 適合快速 Real Time PCR反應(yīng) 高性能的 PCR擴(kuò)增 寬廣范圍內(nèi)準(zhǔn)確定量 靈敏的低拷貝模板檢測 ROX Reference Dye附帶 BSA添加 價(jià)格優(yōu)勢 Real Time PCR 相關(guān)試劑的選擇 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR用引物設(shè)計(jì)合成服務(wù) Real Time PCR檢測技術(shù)服務(wù) Real Time相關(guān)服務(wù) 生物秀 — 專心做生物！ 使用專用引物探針軟件， 免費(fèi)設(shè)計(jì)。 進(jìn)行 RNA引物設(shè)計(jì)時(shí)通常設(shè)計(jì)在 exon junction上，使用 genomic DNA的擴(kuò)增難以進(jìn)行。 技術(shù)不足 條件不足 技術(shù)、條件都不足 021－ 64127324 hello 時(shí)間因素 快速獲得 滿意實(shí)驗(yàn)結(jié)果 生物秀 — 專心做生物！ 客戶提供信息