【正文】 進(jìn)行 RNA引物設(shè)計時通常設(shè)計在 exon junction上，使用 genomic DNA的擴(kuò)增難以進(jìn)行。 試劑選擇的要素 生物秀 — 專心做生物！ 定量范圍寬廣 擴(kuò)增效率高， 起峰時間早 低拷貝檢測清晰 反應(yīng)特異性高， 負(fù)對照擴(kuò)增穩(wěn)定 (無非特異性擴(kuò)增 ) 間隔距離均勻 信號強度高 試劑選擇的要素 生物秀 — 專心做生物！ 實驗項目 以 λDNA （ 1fg、 10fg、 100fg、 1pg、 10pg、 100pg、 1ng） 為模板，進(jìn)行 300bp擴(kuò)增性能及擴(kuò)增特異性檢測。 生物秀 — 專心做生物！ 熱變性 酶切 延伸 Cycling Probe法基本原理 退火 RNase H分解 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 雜合探針 雜合探針 雜合探針 PCR反應(yīng) 模板 DNA 野生型（ wild homo）為 ROX標(biāo)記，突變型（ mutant homo）為 FAM標(biāo)記。 擴(kuò)增效率（ E）： , 越接近 1，越理想。 Real Time PCR用引物與普通 PCR引物設(shè)計要求不同 = 對引物設(shè)計要求嚴(yán)格 普通 PCR引物 Real Time PCR引物 Real Time PCR引物及探針設(shè)計 擴(kuò)增片段大小 ★ 80150bp(盡量限制在 300bp以內(nèi) ) Primer長度 ★ 1725base GC含量 ★ 4060%(最好 4555%) Tm值 ★ ★ ★ 兩條引物的 Tm值盡量接近，引用專用軟件計算 Tm值 序列 ★ 整體上堿基不能過偏 個別部分避免 GC rich或 AT rich(特別是 3’端 ) 避免 T/C連續(xù)， A/G連續(xù) 3’末端序列 ★ 3’末端避免 GC rich或 AT rich 3’末端堿基最好為 G 或 C 3’末端堿基盡量避免為 T 互補性 ★ ★ ★ 引物內(nèi)部或兩條引物之間避免 3base以上的互補序列 引物 3’末端避免 2base以上的互補序列 特異性 ★ ★ ★ 使用 BLAST檢索，確認(rèn)引物特異性 RTPCR用引物 ★★ 盡量在 Exon junction上設(shè)計引物，限制基因組 DNA擴(kuò)增 Real Time PCR用引物設(shè)計原則 ★ 號表示重要程度， ★ 號越多，表示該參數(shù)越重要，設(shè)計時要優(yōu)先考慮 生物秀 — 專心做生物！ 目的基因序列獲得 好的引物 需要尋找好的參照序列 引物設(shè)計 分析序列 特異性確認(rèn) 基因組序列確認(rèn) RefSeq序列 目的基因 Real Time PCR引物及探針設(shè)計 Real Time RTPCR 引物 生物秀 — 專心做生物！ （ 通過 NCBI獲得參考序列和相關(guān)情報。通常 mRNA表達(dá)量分析最適。 480 Cepheid公司 Smart Cycler、 Smart Cycler II、 Smart Cycler 174。 ◆缺點：需要設(shè)計特異性探針，成本高、有時設(shè)計困難。 ( C代表 Cycle， t代表 threshold） Ct值概念 閾值：在擴(kuò)增曲線的指數(shù)增長區(qū)域內(nèi)適當(dāng)位置上 設(shè)定的熒光檢出界限。 Real Time PCR 原理 生物秀 — 專心做生物！ 在 PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)，并實時監(jiān)測熒光信號積累的整個 PCR進(jìn)程，最后通過已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知濃度的樣品進(jìn)行定量分析。 以前對 PCR引物的選擇、 PCR試劑的優(yōu)化 經(jīng)驗不足， Probe法較為廣用。 TD BioRad公司 iCycler iQ、 iQ5 RealTime PCR Detection System Corbett Research公司 Rotorgene202 Rotorgene3000 、 Rotorgene6000 MJ Research公司 Opticon、 MJ Mini Cycler、 MiniOpticon Stratagene公司 Mx4000174。 目的片段在距 Poly(A) Tail 。RefSeq數(shù)據(jù)庫提供無重復(fù)，準(zhǔn)確性，完整性的基因參考序列。 相關(guān)系數(shù) 斜率 擴(kuò)增效率（ E）計算方法 標(biāo)準(zhǔn)曲線 X軸表示起始模板濃度（ log10)， Y軸表示 Ct值時 E=101/a1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 X軸表示 Ct值， Y軸表示起始模板濃度（ log10) E=10a1 生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR 解析方法 ? 標(biāo)準(zhǔn)曲線分析 ? 融解曲線分析 ? 絕對定量和相對定量解析方法 生物秀 — 專心做生物！ Tm值是指雙鏈 DNA分子解鏈一半時的溫度。 利用 Cycleave法的 SNP解析原理 ROX熒光 ROX熒光 FAM熒光 FAM熒光 FAM熒光 ROX熒光 Wild homo hetero Mutant homo SNP point 定性分析應(yīng)用例 對人的 ALDH2基因進(jìn)行 SNP解析 Cycling Probe法 PCRRFLP法 ROX FAM ROX、 FAM通道均有信號檢出 Eco57 I CTGAAG(N)16 GACTTC(N)14 wild type :切斷 Mutant type :不切斷 ROX FAM Mutant wild ROX通道有信號檢出 FAM 通道檢出熒光信號 ROX FAM Mutant wild Mutant wild 雜合型 (hetero) 野生型 (wild homo) 突變型 (mutant homo) 生物秀 — 專心做生物！ 提取樣品 引物、探針設(shè)計 Real Time PCR反應(yīng) 數(shù)據(jù)分析 流 程 定性分析應(yīng)用例 對人的 ALDH2基因進(jìn)行 SNP解析 生物秀 — 專心做生物！ 從人血液中（共計 10個樣品）提取基因組 DNA 實驗樣品 提取試劑： Blood Genome DNA Extraction Kit (TaKaRa ) 定性分析應(yīng)用例 對人的 ALDH2基因進(jìn)行 SNP解析 生物秀 — 專心做生物！ 實驗結(jié)果 定性分析應(yīng)用例 對人的 ALDH2基因進(jìn)行 SNP解析 雜合型 突變型 Sample Sample2: 雜合型 (ROX, FAM 同時檢出） Sample6: 突變型（只有 FAM檢出） 其它 Sample: 野生型（只有 ROX檢出） 生物秀 — 專心做生物！ FAM ROX FAM ROX FAM ROX Sample Sample2 同時檢出 ROX、 FAM Sample6只檢出 FAM Sample3 710 只檢出 ROX 雜合型 突變型 野生型 定性分析應(yīng)用例 對人的 ALDH2基因進(jìn)行 SNP解析 生物秀 — 專心做生物！ 絕對定量應(yīng)用例 對 SARS病毒培養(yǎng)液中所含 SARS病毒 RNA進(jìn)行定量 檢測方法 Taq ManTM probe 法 檢測樣品 3個從 SARS病毒培養(yǎng)液中提取的 genome RNA 目的基因 SARS病毒 RNA 內(nèi) 參 SARS Internal Control RNA 標(biāo) 準(zhǔn) 品 SARS Control RNA 試 劑 One Step RTPCR Kit（ Perfect Real Time） TaKaRa 儀 器 Smart Cycler Ⅱ 生物秀 — 專心做生物！ SYN247 F02 SYN247R03 SYN247 F01 SYN247R02 SYN247R02 Bam HⅠ Hind Ⅲ pBluescript II SK(+) vector T7 promoter Bam HⅠ Hind Ⅲ SacⅠsite SARS Control RNA構(gòu)建 絕對定量應(yīng)用例 對 SARS病毒培養(yǎng)液中所含 SARS病毒 RNA進(jìn)行定量 生物秀 — 專心做生物！ 絕對定量應(yīng)用例 對 SARS病毒培養(yǎng)液中所含 SARS病毒 RNA進(jìn)行定量 純化的 SARS Control RNA OD值測定結(jié)果 體外轉(zhuǎn)錄的 SARS Control RNA 電泳照片 M1 M2 M1: ?Hind Ⅲ digest M2: DL2022 Marker DNase I 處理前 DNase I 處理后 生物秀 — 專心做生物！ ?DNA BNITMSARAs2 Adaptor R SacⅠsite BamHⅠsite BNITMSARS1 Adaptor F T7 promoter SARS Internal Control RNA的構(gòu)建 絕對定量應(yīng)用例 對 SARS病毒培養(yǎng)液中所含 SARS病毒 RNA進(jìn)行定量 A A pBluescriptII SK(+)vector 生物秀 — 專心做生物！ 絕對定量應(yīng)用例 對 SARS病毒培養(yǎng)液中所含 SARS病毒 RNA進(jìn)行定量 體外轉(zhuǎn)錄的 Internal control RNA電泳照片 M1: ? Hind Ⅲ digest M2: DL2022 Marker 純化的 SARS Internal Control RNA OD值測定結(jié)果 M1 M2 DNase I 處理前 DNase I 處理后 生物秀 — 專心做生物！ 探針的選擇 絕對定量應(yīng)用例 對 SARS病毒培養(yǎng)液中所含 SARS病毒 RNA進(jìn)行定量 Template Primer Taq Man Probe 5’端報告基團(tuán) 3’端淬滅基團(tuán) SARS Control RNA or SARS Genome RNA 共用 FAM標(biāo)記 Eclipse標(biāo)記 SARS Internal Control RNA 共用 ROX標(biāo)記 Eclipse標(biāo)記 生物秀 — 專心做生物！ SARS Control RNA105101擴(kuò)增曲線 SARS genome RNA Sample ２、３擴(kuò)增曲線 SARS Internal control RNA擴(kuò)增曲線 標(biāo)準(zhǔn)曲線 絕對定量應(yīng)用例 對 SARS病毒培養(yǎng)液中所含 SARS病毒 RNA進(jìn)行定量 生物秀 — 專心做生物！ 定量結(jié)果 絕對定量應(yīng)用例 對 SARS病毒培養(yǎng)液中所含 SARS病毒 RNA進(jìn)行定量 對三個樣品所含 SARS病毒 RNA進(jìn)行了準(zhǔn)確定量。 試劑名稱 SYBR174。 引物序列不含有已知的 SNP位點 (已在 dbSNP上登錄 ) 通過同源性檢索確認(rèn)了其特異性。 不易形成引物二聚體。 ? 價格因素 → 降低實驗成本。 相對表達(dá)量計算 相對值 = 校正值 = 目的基因定量結(jié)果 管家基因定量結(jié)果 檢測樣品的校正值 對照樣品的校正值 相對定量解析順序 檢測樣品 管家基因 H 目的基因 X 定量結(jié)果 定量結(jié)果 校正值 相對量 RNA樣品 1 RNA樣品 2 RNA樣品 3 543210123相對表達(dá)量（Log2）R N A 樣品1 R N A 樣品2 R N A 樣品3R N A 樣品1R N A 樣品2R N A 樣品3生物秀 — 專心做生物！ Real Time PCR 基礎(chǔ)知識 Real Time PCR 實驗方法 Real Time PCR 解析方法 Rea