【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 背景的確定在板布局面板的右上端，通過組合框選擇背景的相關(guān)板類型。這也是執(zhí)行檢測(cè)項(xiàng)目所需的板類型。如果所需的板類型不包含在選項(xiàng)內(nèi)，必須首先執(zhí)行該背景的校準(zhǔn)。 樣品類型的定義在板布局中選中一個(gè)或更多位置，在被打開的相關(guān)對(duì)話框中編輯，并在隨后出現(xiàn)的工具欄中的，通過圖標(biāo)選擇不同的樣品類型。以上板布局編輯功能也可以通過鼠標(biāo)右鍵或者菜單plate layout項(xiàng)實(shí)現(xiàn)。當(dāng)各項(xiàng)輸入完成后，帶有樣品類型、樣品名稱和sample表中的位置等數(shù)據(jù)的樣品就會(huì)顯示在左邊窗口內(nèi)。在右邊窗口的sample info中，列出了板布局選擇樣品的各數(shù)據(jù)。 標(biāo)準(zhǔn) 當(dāng)圖標(biāo)standard被選中后，出現(xiàn)相關(guān)的對(duì)話框。1 在板布局中樣品的位置2 樣品名稱3 目標(biāo)基因選項(xiàng)的復(fù)選框4 目標(biāo)基因名稱5 檢測(cè)目標(biāo)基因使用的染料6 標(biāo)準(zhǔn)濃度單元7 標(biāo)準(zhǔn)濃度8 內(nèi)部陽性對(duì)照（ipc）選項(xiàng)的復(fù)選框9 內(nèi)部陽性對(duì)照（ipc）染料選項(xiàng)的組合框10 樣品類型符號(hào)在這里，各數(shù)據(jù)和待檢測(cè)目標(biāo)基因都以標(biāo)準(zhǔn)名稱輸入。同時(shí)，在相關(guān)區(qū)域內(nèi)，必須明確用量和濃度的標(biāo)準(zhǔn)。指數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)輸入，例如：1E8。單位copies以及用量＝1都是默認(rèn)設(shè)定的?？梢酝ㄟ^auto series功能來建立標(biāo)準(zhǔn)系列。（）注意：在這個(gè)對(duì)話框里可以進(jìn)行編輯的目標(biāo)基因的數(shù)量取決于在板布局中選擇的染料的數(shù)量。 陽性對(duì)照 選中position control圖標(biāo)以后，將出現(xiàn)如下的對(duì)話框。除了對(duì)照的名稱和目標(biāo)基因的數(shù)據(jù)以外，在此也可以定義基因識(shí)別（gene identification）分析模式下，作為等位基因的陽性對(duì)照。首先需要完成作為等位基因的陽性對(duì)照的編輯。在analysis下進(jìn)行隨后的識(shí)別時(shí)，對(duì)話框里每個(gè)等位基因都被自動(dòng)分配一個(gè)顏色。也可以在amount欄內(nèi)輸入數(shù)值。但這在隨后的分析中不是絕對(duì)必要的。 陰性對(duì)照 當(dāng)選中negative control圖標(biāo)后，相關(guān)對(duì)話框被打開。在此對(duì)話框中只輸入陰性對(duì)照的名稱和目標(biāo)基因數(shù)據(jù)。 未知樣品 當(dāng)unknown圖標(biāo)被選中后，如下的對(duì)話框被打開。除了未知樣品名稱和目標(biāo)基因數(shù)據(jù)以外，通過功能鍵auto series還可以在此編輯復(fù)制。（）在對(duì)話框的下端包括use of target gene(s) as面板和relative quantification/gene expression面板：use of target gene(s) as：可以通過一個(gè)內(nèi)部陽性對(duì)照或者選定相關(guān)功能鍵作為持家基因設(shè)定目標(biāo)基因，然后用組合框確定各自的染料。分析中由內(nèi)部陽性對(duì)照或者作為持家基因設(shè)定的基因被加亮為黃色。Relative quantification/gene expression：在此目標(biāo)基因被定義為relative quantification/gene expression分析模式下的校準(zhǔn)器。對(duì)于monoplex分析，通過組合框well with housekeeping gene(monoplexing)持家基因的孔可以與樣品關(guān)聯(lián)。 復(fù)制和標(biāo)準(zhǔn)系列的自動(dòng)建立當(dāng)樣品類型為標(biāo)準(zhǔn)（standard）和未知（unknown）時(shí)，可以自動(dòng)建立復(fù)制。在編輯標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，也可以自動(dòng)建立標(biāo)準(zhǔn)系列。首先在要建立標(biāo)準(zhǔn)系列和復(fù)制的板布局內(nèi)至少選擇兩個(gè)位置。 為化簡(jiǎn)標(biāo)準(zhǔn)系列和復(fù)制的建立，使用new standard對(duì)話框。其中包含有auto series項(xiàng)。注意：只有當(dāng)板布局中超過一個(gè)位置被選中后，該功能才能被激活。擴(kuò)充對(duì)話框指明了板布局中被選中的位置，被分為復(fù)制和稀釋兩個(gè)區(qū)域。復(fù)制：在編輯框中輸入復(fù)制的數(shù)量，另外，該項(xiàng)也可以用來定義板內(nèi)復(fù)制布置形成基準(zhǔn)的形式。相關(guān)復(fù)制可以布置成水平相鄰或者垂直相鄰的形式。以不同的方向，不同的復(fù)制可以相鄰的排成行或者列。為說明的目的，形式顯示在窗口preview中。稀釋：使用編輯框來明確稀釋元素和稀釋步驟數(shù)。通過組合框order可以明確采用升序還是降序。在preview calculated amounts欄中，通過組合框選中一個(gè)染料，根據(jù)在目標(biāo)基因中定義的濃度初始值，顯示濃度最終值。注意：這個(gè)區(qū)域在unknowns擴(kuò)充對(duì)話框中處于不活動(dòng)狀態(tài)。點(diǎn)擊ok確認(rèn)該對(duì)話框后，在被選區(qū)域內(nèi)建立起與參數(shù)數(shù)量相同的組數(shù)。當(dāng)用未知樣品建立復(fù)制時(shí)，整個(gè)被選區(qū)域被填滿。樣品名稱和所有相關(guān)的數(shù)據(jù)都被自動(dòng)分配。對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)系列的單一標(biāo)準(zhǔn)的濃度數(shù)據(jù)也被自動(dòng)顯示在板布局中。 定量的樣品類型為了定量樣品中的初始核酸，要用一個(gè)未知的初始核酸量從樣品中建立起一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。為了這樣的目的，首先編輯板布局中的標(biāo)準(zhǔn)，然后編輯未知樣品。陰性對(duì)照也要編輯。編制標(biāo)準(zhǔn)系列的例子：目標(biāo)是建立一個(gè)10－100000拷貝的三重復(fù)制子的標(biāo)準(zhǔn)系列，復(fù)制布置為彼此相鄰以行排列?？截惖淖罡邤?shù)量放置在位置A1－C1上，稀釋系列采用降序，水平列，每步稀釋10倍?！?在板布局中選擇區(qū)域A1－E3— 打開standard對(duì)話框，其中包含附加auto series項(xiàng)。— 輸入?yún)?shù)— 點(diǎn)擊ok確認(rèn)輸入。使得板布局為：未知樣品復(fù)制編程例子：目標(biāo)是定義未知樣品三重復(fù)制子目標(biāo)基因，三倍復(fù)制被相鄰放置在位置A1－C1上?！?在板布局上選中區(qū)域A1－C1?！?打開包含有auto series項(xiàng)的unknown對(duì)話框?！?輸入各參數(shù)?！?點(diǎn)擊ok以確認(rèn)。使得板布局為： 相對(duì)定量的樣品類型相對(duì)定量中，是在目標(biāo)基因之間做比較，這些基因具有不同的表達(dá)水平，分別來自經(jīng)過各自處理的樣品中。它們分別與非調(diào)控的參考基因（持家基因）相比。然后根據(jù)方法計(jì)算出其表達(dá)水平。所有的樣品均作為未知基因進(jìn)行編輯。 多plex分析例子在多plex分析中，目標(biāo)基因和持家基因在一個(gè)試管內(nèi)用兩種不同的染料進(jìn)行檢測(cè)。加工過的樣品：— 在板布局中選擇B2－B4區(qū)域— 打開unknown對(duì)話框— 通過target gene（s）面板選擇兩個(gè)基因?！?通過在housekeeping gene復(fù)選框，在use of target gene(s)面板中明確 持家基因，用組合框選擇相關(guān)的染料?！?點(diǎn)擊ok以確認(rèn)?！?將位于B2－B4的樣品組成一組。未經(jīng)處理的樣品（校準(zhǔn)器）— 在板布局中選擇C2－C4區(qū)域?！?打開unknown對(duì)話框?！?通過target gene(s)對(duì)話框選擇兩個(gè)基因— 通過在housekeeping gene復(fù)選框，在use of target gene(s)面板中明確 持家基因，用組合框選擇相關(guān)的染料?！?在relative quantification/gene expression面板中，選中復(fù)選框set sample as calibrator來將樣品定義為校準(zhǔn)器?！?點(diǎn)擊ok以確認(rèn)。— 將位于C2－C4的樣品化為一組。處理過的樣品：未經(jīng)處理的樣品：樣品被編輯完成后，板布局如下圖所示：用作校準(zhǔn)器的樣品有淡顏色條的標(biāo)志。 單plex分析的例子對(duì)于單plex分析，目標(biāo)基因和持家基因在不同的試管內(nèi)接受檢測(cè)，使用同樣的染料。處理過的樣品：a）— 在板布局中選擇C2－C4區(qū)域?！?打開unknown對(duì)話框?！?在target gene(s)面板中輸入 持家基因的名稱?！?通過在housekeeping gene復(fù)選框，在use of target gene(s)面板中明確持家基因，用組合框選擇相關(guān)的染料?！?點(diǎn)擊ok以確認(rèn)?！?將位于C2－C4的樣品歸為一組。b)— 在板布局中選中B2－B4區(qū)域?！?打開unknown對(duì)話框?！?在target gene(s)面板中輸入目標(biāo)基因的名稱?！?點(diǎn)擊ok關(guān)閉unknown對(duì)話框。— 將位于B2－B4的樣品歸為一組?！?在該組內(nèi)選中至少一個(gè)位置，然后在此打開unknown對(duì)話框。— 通過組合框well with housekeeping gene(monoplexing)向孔內(nèi)分配（或賦值），其中 持家基因在此被檢測(cè)到。選擇C2－C4的其中一個(gè)包含有持家基因的位置。在計(jì)算中，結(jié)果將合并分組樣品的平均值?！?點(diǎn)擊ok以確認(rèn)。a) 處理過的樣品（目標(biāo)基因）b) 處理過的樣品（持家基因）未經(jīng)處理的樣品a)— 在板布局內(nèi)選擇C5－C7區(qū)域?！?打開unknown對(duì)話框?！?在target gene(s)面板中輸入持家基因的名稱。— 通過在housekeeping gene復(fù)選框，在use of target gene(s)面板中明確持家基因，用組合框選擇相關(guān)的染料?！?在relative quantification/gene expression面板中，通過復(fù)選框set sample as calibrator定義樣品為校準(zhǔn)器。— 點(diǎn)擊ok以確認(rèn)?！?將位于C5－C7的樣品歸為一組。b)— 在板布局中選擇B5－B7區(qū)域?！?打開unknown對(duì)話框?！?在target gene(s)面板中輸入目標(biāo)基因的名稱?！?點(diǎn)擊ok以關(guān)閉unknown對(duì)話框?！?將位于B5－B7的樣品歸為一組?！?在該組內(nèi)選中至少一個(gè)位置，然后再次打開unknown對(duì)話框。— 通過組合框well with housekeeping gene(monoplexing)向孔內(nèi)分配（或賦值），其中持家基因在此被檢測(cè)到。選擇C5－C7的其中一個(gè)包含有持家基因的位置。在計(jì)算中，結(jié)果將合并分組樣品的平均值?！?點(diǎn)擊ok以確認(rèn)。樣品編輯完成后，板布局如下圖所示： 熔點(diǎn)分析中的樣品類型在熔解曲線分析中，沒有特別需要考慮的方面。 終點(diǎn)測(cè)定中的樣品類型在執(zhí)行終點(diǎn)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，陰性對(duì)照和未知樣品需要被查實(shí)。 +/檢測(cè)項(xiàng)目中的樣品類型執(zhí)行一個(gè)+/檢測(cè)項(xiàng)目時(shí)，除了未知樣品以外，還需要編輯陽性和陰性對(duì)照。 樣品的復(fù)制與剪切該過程中用到的copy, cut和paste命令既可以通過鼠標(biāo)右鍵，也可以通過菜單plate layout來實(shí)現(xiàn)。為復(fù)制板布局樣品，首先選中樣品，然后通過copy命令復(fù)制樣品到剪切板上。隨后在板布局中選中一個(gè)位置，再使用paste命令將樣品類型插入其中。Cut命令可以用來剪切樣品，然后在板布局另一位置通過paste命令插入該樣品。 刪除樣品 首先選中一個(gè)或者多個(gè)樣品，然后點(diǎn)擊圖標(biāo)delete samples來刪除樣品。 幾個(gè)樣品的歸組，也可以通過將板布局中已存在的樣品歸為一組的形式建立復(fù)制。歸為一組的前提是樣品類型和其他數(shù)據(jù)之間是對(duì)應(yīng)的。組內(nèi)的樣品名稱不一定要相同。 如果板布局內(nèi)的幾個(gè)樣品被加亮后，再選中g(shù)roup圖標(biāo)，那么這些樣品就歸為了一個(gè)組，可以自動(dòng)進(jìn)行復(fù)制的統(tǒng)計(jì)分析了。被歸為一組的樣品在板布局內(nèi)帶有顏色加亮的標(biāo)志，位于板布局的右下方。改變顏色可以通過再次點(diǎn)擊group as replicates圖標(biāo)。 組可以通過點(diǎn)擊ungroup replicates圖標(biāo)取消。 子檢測(cè)項(xiàng)目的測(cè)定在pcr板上執(zhí)行幾個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目，單個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目會(huì)帶有子檢測(cè)項(xiàng)目的標(biāo)志，可以由軟件稍后分別作出分析。這就意味著可以平行的執(zhí)行兩個(gè)不同的檢測(cè)項(xiàng)目，每個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目都可以有各自的具有不同目標(biāo)基因和染料的樣品。板布局中給出了一個(gè)例子，其中兩個(gè)以兩種不同標(biāo)準(zhǔn)系列和不同的未知樣品的目標(biāo)基因被測(cè)定。前提條件是這兩個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目包含有相同的pcr程序，并且數(shù)據(jù)采集發(fā)生在相同的pcr步驟內(nèi)。 如果加亮板布局內(nèi)的所有子系統(tǒng)的樣本，然后選中create subassay圖標(biāo)，這些樣本就會(huì)作一個(gè)框架的標(biāo)志。注意：板布局中的空白位置也可以一開始就被選中作為子檢測(cè)項(xiàng)目。這種方法一般都用在隨后進(jìn)行的檢測(cè)項(xiàng)目單一樣品類型的測(cè)定。在程序執(zhí)行和分析過程中（），子檢測(cè)項(xiàng)目樣品的顯示是分別執(zhí)行的。單個(gè)子程序和它們?cè)诎宀季种械奈恢蔑@示在結(jié)點(diǎn)monitoring下，如果選中某一個(gè)子程序，與之相關(guān)的數(shù)據(jù)就被加載到右邊的工作區(qū)中。 組可以通過delete subassay圖標(biāo)被打破。在此之前，要先選中相應(yīng)的樣品。注意：在一個(gè)pcr板上執(zhí)行兩個(gè)不同檢測(cè)項(xiàng)目的前提條件是這兩個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目用一個(gè)pcr程序執(zhí)行，并且在同一個(gè)溫度步驟中獲取熒光數(shù)據(jù)。 板布局的刪除 當(dāng)選中clear plate時(shí)，板布局內(nèi)的所有樣本都會(huì)被刪除。 完整檢測(cè)項(xiàng)目的板布局編輯不能編輯完整檢測(cè)項(xiàng)目的板布局。為了做出隨后的變動(dòng)，首先必須先將板布局激活。 通過點(diǎn)擊edit mode for plate圖標(biāo)，一個(gè)完整檢測(cè)項(xiàng)目的封鎖狀態(tài)的板布局可以再一次被激活。一旦編輯完成，板布局可以通過再次點(diǎn)擊該圖標(biāo)被鎖住。所有在板布局中并發(fā)的改變都會(huì)被記錄在userlog中。 pcr程序的建立為編輯pcr程序，工具欄里的所有如下圖所示的功能都是可以用到的：1 插入步2 編輯步3 刪除步4清除pcr程序5 顯示梯度功能6 設(shè)置測(cè)量點(diǎn)注意：以上這些功能也可以通過鼠標(biāo)右鍵或者pcr program菜單實(shí)現(xiàn)。 用模板程序建立一個(gè)pcr程序當(dāng)向?qū)趦?nèi)的子項(xiàng)pcr program被選中后，一個(gè)包含有3步循環(huán)的模板程序，作為一個(gè)新的檢測(cè)項(xiàng)目，就會(huì)顯示在右邊窗口中。 為編輯程序，要先選中其中一步，通過edit step圖標(biāo)彈出對(duì)話框，在該對(duì)話框中可以修改溫度，時(shí)間和循環(huán)數(shù)等數(shù)據(jù)。另外edit step對(duì)話框也可以通過雙擊某一步彈出。在這個(gè)對(duì)話框中還可以對(duì)增量，梯度功能，制熱和制冷率進(jìn)行設(shè)置。（）另外，通過選中對(duì)象和添加，溫度，時(shí)間和循環(huán)數(shù)等數(shù)據(jù)也可以在pcr程序中被直接修改。注意：加熱蓋和熱模塊的特性可以在program header中修改（）。 不用模板程序建立pcr程序 不用模板程序建立pcr程序，首先通過點(diǎn)擊clear pcr p