實(shí)時(shí)熒光pcr技術(shù)(編輯修改稿)
2024-09-11 21:50 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 n SYBR Green 法 定量原理 ? 模板 DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少 ? Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品 Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量 SYBR Green 法 PCR反應(yīng)的建立 反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化 : 1. SYBR Green 使用濃度 :太高抑制 Taq酶活性，太低，熒光信號(hào)太弱，不易檢測(cè) 2. Primer：引物的特異性高，否則擴(kuò)增有雜帶，定量不準(zhǔn) 3. MgCl2的濃度 :可以降低到 ,以減少非特異性產(chǎn)物 4. 反應(yīng) Buffer 體系的優(yōu)化 5. 反應(yīng)溫度和時(shí)間參數(shù) :由酶和引物決定 6. 其他與常規(guī) PCR相同 SYBR Green 法 應(yīng)用范圍 ? 起始模板的測(cè)定 ? 基因型的分析 ? 融解曲線分析：可以優(yōu)化 PCR反應(yīng)的條件，對(duì)常規(guī) PCR有指導(dǎo)意義，如對(duì) primer的評(píng)價(jià)；可以區(qū)分單一引物、引物二聚體、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物。 SYBR Green 法 優(yōu)缺點(diǎn) ? 對(duì) DNA模板沒有選擇性 適用于任何 DNA ? 使用方便 不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針 ? 非常靈敏 ? 便宜 優(yōu) 點(diǎn) ? 容易與非特異性雙鏈 DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽性 但可以通過 融解曲線的分析 ，優(yōu)化反應(yīng)條件 ? 對(duì)引物特異性要求較高 缺 點(diǎn) 與目標(biāo)序列互補(bǔ) 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 方法 2 TaqMan法 TaqMan水解型雜交探針 ? 5′ 端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán) (Reporter, R) ，如 FAM、 VIC等 ? 3′ 端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán) (Quencher, Q) ? 探針完整， R所發(fā)射的熒光能量被 Q基團(tuán)吸收 ，無熒光， R與 Q分開，發(fā)熒光 ? Taq酶有 5′→3′ 外切核酸酶活性，可水解探針 TaqMan法 工作原理 每擴(kuò)增一條 DNA分子，釋放一個(gè)熒光信號(hào)，可以在循環(huán)過程中任一點(diǎn)檢測(cè)熒光 TaqMan 法 PCR反應(yīng)的建立 引物、探針的設(shè)計(jì)： 探針 Tm為 6870℃ ， 30 bp, 5’不能有 G， G可能會(huì)淬滅熒光素， 引物盡量靠近探針，擴(kuò)增片段 400 bp，引物 Tm為 5960℃ 反應(yīng)參數(shù)的確定： 一般為： 94 ℃ ， 1020S 60℃ ， 3060S（ Taq酶 5′→3′ 外切核酸酶活性在 60℃ 最高） 也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度
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