免疫熒光技術(shù)(編輯修改稿)
2024-09-01 02:48 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 0， 20min）； 4. 封閉（ 6%山羊血清， 30min）； 5. 一抗孵育（一抗?jié)舛?，濕盒?4℃ 過夜， PBS漂洗）； 6. 二抗孵育（二抗種屬，濕盒，室溫 1h，避光， PBS漂洗）； 7. 復(fù)染核（ DAPI，避光， 5min， PBS漂洗）； 8. 封片（熒光淬滅劑的封片液）； 9. 熒光顯微鏡下觀察采集圖像 。 1. 細(xì)胞的固定 【固定的定義】 將新鮮的活體組織或細(xì)胞，立即加入固定液中，以此使細(xì)胞保持原有形態(tài)、結(jié)構(gòu)的一種方法。 【固定的意義】 組織和細(xì)胞的蛋白質(zhì)凝固，終止內(nèi)源性或外源性酶反應(yīng)，原位保存抗原，避免抗原失活或彌散。 停止細(xì)胞中的生化反應(yīng)，固定其中的各種生化物質(zhì)狀態(tài)，防止細(xì)胞死亡后出現(xiàn)自溶分解。 使細(xì)胞中蛋白質(zhì)、脂肪、糖、酶等成分轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄晕镔|(zhì)，以保持生前形態(tài)。 固定細(xì)胞形態(tài)，防止其變形或破裂。 使組織內(nèi)各種物質(zhì)產(chǎn)生不同的折光率，便于觀察和鑒定。 使不同組織成分對(duì)染料有不同的親和力，便于染色。 免疫熒光實(shí)驗(yàn)流程中一些注意事項(xiàng) 【固定液的選擇】 冰凍切片制備： 建議用新鮮組織，否則組織細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞，易使抗原彌散。 選用干凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等，防止裂片和脫片嚴(yán)重。 血清封閉： 為防止內(nèi)源性非特異性蛋白抗原的結(jié)合，需要在一抗孵育前先用血清（與二抗來源一致）封閉，減弱背景著色。 封閉是血清與非特異性位點(diǎn)結(jié)合，以消除非特異性染色，提高目的蛋白的準(zhǔn)確性和降低背景。 血清封閉的時(shí)間是可以調(diào)整的，一般 30min。 一抗孵育條件： 在免疫熒光實(shí)驗(yàn)中最重要，包括孵育時(shí)間和抗體濃度； 一抗孵育溫度有幾種： 4度、室溫、 37度，其中 4度效果最佳； 孵育時(shí)間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般 37度 12h，而 4度過夜和從冰箱拿出后 37度復(fù)溫 45min； 具體條件還要摸索。 復(fù)染： 目的是形成細(xì)胞輪廓，從而更好地對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位； 一般常用 DAPI復(fù)染。 封片： 為了長期保存，我們一般用緩沖甘油等封片，此外還有專門的抗熒光萃滅封片液； 避免產(chǎn)生氣泡。 二抗孵育條件： 二抗一般室溫或 37度 30min1h，具體時(shí)間需要摸索； 而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度； 切記要避光反應(yīng)； 但在免疫熒光中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間先定下，然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間； 最后，熒光素標(biāo)記的二抗隨著保存時(shí)間的延長，可能后有大量的游離熒光素殘留，需要注意配制時(shí)小包裝和并進(jìn)行適當(dāng)?shù)碾x心。 切片清洗： 為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗（延長時(shí)間 和增多次數(shù)）尤為重要，一般在一抗的清洗是 5min*3次； 注意（ 1）單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。 （ 2）溫柔沖洗，防止切片的脫落； （ 3）沖洗的時(shí)間要足夠，才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)。 （ 4） PBS的 PH和離子強(qiáng)度的使用和要求，建議 PH在 。 （中性及弱鹼性條件（ PH78）有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解； 低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度則有利于分解） 拍照： 封好片和用指甲油封固，保持避光和濕度； 正確使用熒光顯微鏡，防止紫外線對(duì)眼睛的損害； 檢查時(shí)間每次以 1~2h為宜，超過 90m
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