[醫(yī)學(xué)]酶免疫技術(shù)(編輯修改稿)
2025-01-03 23:12 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 ?十二烷基磺酸鈉 聚丙烯酰胺凝膠電泳（ SDSPAGE） + 蛋白轉(zhuǎn)運(yùn) + 酶免疫技術(shù) ?將含有目標(biāo)蛋白 (抗原 )的樣品 → SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDSPAGE)或非變性電泳(NativePAGE)等分離 → 轉(zhuǎn)移電泳原位轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜或其它膜的表面 → 將膜表面的蛋白質(zhì)再用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行特異性檢測(cè)。 生物素與親和素系統(tǒng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) BiotinAvidin System ELISA（ BASELISA） ? 生物素 親和素系統(tǒng) (biotinavidin system， BAS)，是 70年代后期應(yīng)用于免疫學(xué)，并得到迅速發(fā)展的一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。 ?多級(jí)放大效應(yīng) 靈敏 ?生物素與親和素之間高度親和力 特異 ?穩(wěn)定 ?適用性強(qiáng)（與熒光素、酶、同位素等免疫標(biāo)記技術(shù)有機(jī)地結(jié)合） 1/3/2022 ELISA試劑的選用和質(zhì)檢 1/3/2022 影響試劑盒質(zhì)量的因素 試劑盒的選用 試劑盒的質(zhì)檢方法 目前試劑盒存在的問(wèn)題 1/3/2022 影響試劑盒質(zhì)量的因素 1． 原材料 (1)固相材料 商品 ELISA試劑盒中基本上都使用聚苯烯塑料微孔板 ， 其對(duì) ELISA試劑盒的影響在于孔間的顯色差異 。 (2)抗原 自然抗原 、 合成抗原和基因重組抗原。 純度：純度不高可致試劑盒的特異性不強(qiáng) 。 立體結(jié)構(gòu)：合成抗原一般都是多肽抗原 ， 缺乏完整抗原所具有的立體結(jié)構(gòu)決定簇 ， 可能導(dǎo)致結(jié)合上述決定簇的抗體漏檢 。 1/3/2022 影響試劑盒質(zhì)量的因素 (3)抗體 ? 多克隆抗體 (多抗 )：制備簡(jiǎn)單 ， 含針對(duì)抗原的多種決定簇 ， 但抗體的親和力和特異性相對(duì)要低于單抗 ， 且每次制備的抗體在其親和力和特異性上均有區(qū)別 。 ? 單克隆抗體 (單抗 )：可無(wú)限大量的得到針對(duì)單一決定簇的抗體 ， 缺點(diǎn)是結(jié)合的單一性 。 當(dāng)建立雙抗夾心 ELISA測(cè)定方法時(shí) ， 如包被和指示抗體使用同一單抗 ， 則由于結(jié)合位點(diǎn)的缺乏 ， 很容易造成假陰性結(jié)果 ， 尤其是在使用一步法時(shí) “ 鉤狀 ” 效應(yīng)(Hookeffect)的出現(xiàn) 。 因此 ， 在使用單抗建立雙抗夾心 ELISA方法時(shí) ， 包被抗體可為混合單抗 ， 從而使得固相抗體在免疫測(cè)定中能更為完全地結(jié)合待測(cè)物中的特異抗原 。 1/3/2022 影響試劑盒質(zhì)量的因素 (4)酶結(jié)合物 ELISA試劑盒的核心部分 ， 通常ELISA試劑盒的有效使用期限即是根據(jù)酶結(jié)合物的穩(wěn)定性而定的 。 ?辣根過(guò)氧化物酶 (HRP)：易于提取 ， 價(jià)格相對(duì)低廉；性質(zhì)穩(wěn)定 ， 耐熱及有機(jī)溶劑的作用 ，與抗原或抗體偶聯(lián)后 ， 活性很少受損失 。 ?堿性磷酸酶 (ALP)： 堿性磷酸酶用于 ELISA必須注意的是含磷酸鹽的緩沖液對(duì)其酶活性的抑制作用 1/3/2022 影響試劑盒質(zhì)量的因素 (5)色原底物： HRP最常用的色原底物有鄰苯二胺 (OPD)和四甲基聯(lián)苯胺 (TMB) 。 ? 鄰苯二胺 (OPD)： OPD被認(rèn)為是 HRP最為敏感的色原底物之一 ， 當(dāng) pH值降為 ， 最大吸收波長(zhǎng)為492nm， 顯色加深 ， 因而常用強(qiáng)酸如硫酸或鹽酸終止反應(yīng) 。 OPD的缺點(diǎn)是其對(duì)機(jī)體具有致突變作用 。 ? 四甲基聯(lián)苯胺 (TMB)： 氧化產(chǎn)物聯(lián)苯醌在波長(zhǎng) 450nm處有最大消光系數(shù) 。 試劑盒中常為已配好的 A、 B兩種液態(tài)試劑 ， 即一定濃度雙氧水溶液和 TMB。 它們?cè)谌芤褐邢鄬?duì)不穩(wěn)定 ， 因此在使用 ELISA試劑盒時(shí) ，如底物 A或／和 B出現(xiàn)顏色 ， 或各取一滴混合后顯色， 說(shuō)明該試劑盒的底物溶液已變質(zhì)或已受污染 ， 必須廢棄 。 1/3/2022 影響試劑盒質(zhì)量的因素 3． 試劑盒的運(yùn)輸和貯存 ELISA試劑盒的效期一般為 6個(gè)月 ， 這是指在貯存溫度為 2～ 8186。C的情況下 ， 但一個(gè)試劑盒從出廠至用戶(hù)手中 ， 均要經(jīng)歷運(yùn)輸 (如送檢 、 檢定 、 發(fā)貨等 )及運(yùn)輸中的貯存 ， 某一環(huán)節(jié)的不當(dāng) ， 均會(huì)影響試劑盒的臨床使用質(zhì)量 。 1/3/2022 試劑盒的選用 1． 根據(jù)可能影響試劑盒質(zhì)量的因素 ， 從以下幾個(gè)方面來(lái)判斷該試劑盒是否符合我們的要求 ? 效期 ? 固相材料的來(lái)源 ? 包被抗體或抗
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