實時定量pcrppt課件(編輯修改稿)
2025-02-13 16:43 本頁面
【文章內容簡介】 NA水平 RNA水平 蛋白水平 RTPCR基本原理 mRNA AAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTT Reverse Transcription mRNA AAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTT cDNA RTPCR一般步驟 ? RNA提取 RNA質量的檢測 一般 RTPCR要求提取的 RNA要有較高的 完整性 和 純度 完整性檢測（ 1%瓊脂糖膠電泳） 純度檢測（ OD260/280） OD260/280一般介于 ，小于 時蛋白污染；大于 RNA發(fā)生降解 28S 18S 5S ?反轉錄 RTPCR一般步驟 在冰盒上加入以下試劑： 組成 體積 隨機引物 或 Oligo dT） 1μL 15μg Total RNA xμL DEPCTreated H2O yμL 體系配制完成后瞬時離心， 70℃ 反應5min,然后迅速轉移至冰盒，冰浴 25min,此步驟的作用是 去除 mRNA的二級結構 。 RTPCR一般步驟 組成 體積 5X Buffer 4μL dNTPs 1μL RNAse inhibitor 1μL MMLV 1μL DEPCTreated H2O xμL 混勻， 42℃ ， 90min 70℃ ， 10min，終止反應 A3檢測 在冰盒上加入以下試劑： 反向 PCR (reverse） PCR) 已知序列 未知序列 未知序列 ? 反向 PCR是用反向的互補引物來擴增兩引物以外的 DNA片段對某個已知 DNA片段兩側的未知序列進行擴增 。 ? 可對未知序列擴增后進行分析 ,如探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長cDNA的克隆 ,擴增基因文庫的插入 DNA；建立基因組步移文庫。 已知序列 未知序列 未知序列 限制酶 限制酶 連接酶 反向 PCR原理 ? cDNA 末端快速擴增技術 (Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE)是一種基于 PCR技術從低豐度的轉錄本中快速擴增 cDNA 的 539。和 3’末端的有效方法 ,以其簡單、快速、廉價等優(yōu)勢而受到越來越多的重視。 RACE (rapidamplification of cDNA ends) AAAAAAAA mRNA 接頭序列 AAAAAAAA mRNA GeneRacer 339。Primer GSP2 GeneRacer 339。Nested Primer NGSP2 Reverse transcription
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