實(shí)時(shí)定量pcrppt課件(編輯修改稿)
2025-02-13 16:43 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 NA水平 RNA水平 蛋白水平 RTPCR基本原理 mRNA AAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTT Reverse Transcription mRNA AAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTT cDNA RTPCR一般步驟 ? RNA提取 RNA質(zhì)量的檢測(cè) 一般 RTPCR要求提取的 RNA要有較高的 完整性 和 純度 完整性檢測(cè)（ 1%瓊脂糖膠電泳） 純度檢測(cè)（ OD260/280） OD260/280一般介于 ，小于 時(shí)蛋白污染；大于 RNA發(fā)生降解 28S 18S 5S ?反轉(zhuǎn)錄 RTPCR一般步驟 在冰盒上加入以下試劑： 組成 體積 隨機(jī)引物 或 Oligo dT） 1μL 15μg Total RNA xμL DEPCTreated H2O yμL 體系配制完成后瞬時(shí)離心， 70℃ 反應(yīng)5min,然后迅速轉(zhuǎn)移至冰盒，冰浴 25min,此步驟的作用是 去除 mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu) 。 RTPCR一般步驟 組成 體積 5X Buffer 4μL dNTPs 1μL RNAse inhibitor 1μL MMLV 1μL DEPCTreated H2O xμL 混勻， 42℃ ， 90min 70℃ ， 10min，終止反應(yīng) A3檢測(cè) 在冰盒上加入以下試劑： 反向 PCR (reverse） PCR) 已知序列 未知序列 未知序列 ? 反向 PCR是用反向的互補(bǔ)引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的 DNA片段對(duì)某個(gè)已知 DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增 。 ? 可對(duì)未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析 ,如探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長(zhǎng)cDNA的克隆 ,擴(kuò)增基因文庫(kù)的插入 DNA；建立基因組步移文庫(kù)。 已知序列 未知序列 未知序列 限制酶 限制酶 連接酶 反向 PCR原理 ? cDNA 末端快速擴(kuò)增技術(shù) (Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE)是一種基于 PCR技術(shù)從低豐度的轉(zhuǎn)錄本中快速擴(kuò)增 cDNA 的 539。和 3’末端的有效方法 ,以其簡(jiǎn)單、快速、廉價(jià)等優(yōu)勢(shì)而受到越來(lái)越多的重視。 RACE (rapidamplification of cDNA ends) AAAAAAAA mRNA 接頭序列 AAAAAAAA mRNA GeneRacer 339。Primer GSP2 GeneRacer 339。Nested Primer NGSP2 Reverse transcription
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