pcr及分子標記ppt課件(編輯修改稿)
2025-01-31 20:05 本頁面
【文章內容簡介】 neral oil 生命經緯 Selection for DNA polymerase Klenow酶 早期采用 該酶不耐熱，缺點有 ①溫度要求低 (37℃) ，受熱即失活； ②產物特異性不高； ③積累大量的失活殘酶，使反應產物純度大大降低； ④擴增的最長序列約 400bp（ Taq酶則能擴增 10kb） 生命經緯 thermostable DNA polymerases ① Taq DNA polymerase ② Tth DNA polymerase— from ③ VENT DNA polymerase— from ④ Sac polymerase ⑤ pfu polymerase 生命經緯 Taq DNA聚合酶 ?分離 :1969年，美國黃石國家公園溫泉 ?分子量 :94KDa ?活性 ：在幾種水生棲熱菌中活性最高， 200 000U/mg 生命經緯 Taq DNA聚合酶 離子需要 ：對 Mg2+、 單價離子性質和濃度較 敏感。最適濃度為 50mmol/L。 忠實性 :沒有校正單核苷酸錯配功能 致命弱點。一般出錯率為 2 104核苷酸 /每輪循環(huán)，利用 PCR克隆、測序時尤應注意。 生命經緯 Taq DNA聚合酶 抑制劑 :尿素、乙醇、 DMSO、 DMF、甲酰胺、SDS 及許多其他化學藥劑。 內源 DNA:不同來源的酶可能由于制備過程中殘留的原細菌 DNA或 PCR產物的污染而含有不明來源的 DNA。在使用擴增保守序列的通用引物時，會在無模板對照管出現(xiàn)擴增帶。 保存 :在 20℃ 至少 6個月。 生命經緯 PCR optimization 變性溫度和時間 9295℃ ，富含 G和 C的序列，可適當提高，但過高或時間過長都會導致酶活性損失。 退火溫度與時間 引物中 G、 C含量高、 長度長并與模板完全配對時，應提高溫度。溫度越高，產物特異性越高。通常 3755℃ 、 12分鐘。 延伸溫度和時間 溫度： 72℃ ，接近 Taq酶的最適 75℃ 時間：過長會導致產物非特異性增加。但對低濃度的目的序列，則可適當增加時間。 循環(huán)次數(shù) 循環(huán)過多，非特異性產物大量增加 生命經緯 PCR污染及其對策 強大擴增能力 +檢測的敏感性 極微量的污染便可導致假陽性 污染源的追蹤 ①點樣器和加樣器 。② 離心機 。③ 微解剖刀 。④ 濃縮用具、真空瓶 。⑤ 電泳裝置 。⑥ 紫外燈箱 。⑦ 乙醇或水浴鍋 。⑧ 冰箱門把手、實驗臺面等 生命經緯 污染的預防 (1)隔離不同操作區(qū) (2)分裝試劑 (3)改進實驗操作 (4)專用加樣器 (5)結果的重演 PCR技術的應用 生命經緯 遺傳性疾病 地中海貧血的基因診斷 血友病 苯丙酮尿癥 生命經緯 傳染性疾病 肝炎 性病 腫瘤 生命經緯 法醫(yī)學 個人識別、親子鑒定 1985年，英國遺傳學家 Jeffreys采用 DNA 指紋圖譜進行個人識別和親子鑒定。 有時犯罪物證量很少，不足以用來進行DNA指紋分析， PCR有效解決這些問題。對于犯罪現(xiàn)場中遺留的少量生物物證，如一根毛發(fā)、一滴血等都可用于分析，在法醫(yī)學上 認證罪犯 、 親子鑒定 以及 人的性別鑒定 中 PCR技術被普遍采用。 生命經緯 植物遺傳育種 構建遺傳圖譜、分離目的基因、 基因定位 分子標記輔助育種 了解不同品種間的親緣關系、系統(tǒng)進化
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