【文章內(nèi)容簡介】 長度 （ 1） 引物長度 ： 1840nt,常用 2024nt **至少 18nt,這樣才能保證擴(kuò)增反應(yīng)的 特異性 **太長，則致退火時(shí)引物與模板結(jié)合不充分， 擴(kuò)增產(chǎn)物減少 3） 引物（ primer)及其濃度 （ 2） 引物跨度 ：以 200500bp為宜 特定條件下可擴(kuò)增長至 10kb的片段 （ 3） 引物序列 ：除 與靶序列兩側(cè)匹配 外，還應(yīng)與核酸數(shù)據(jù)庫的其它序列 不匹配 (無明顯同源性） （ 4） 引物濃度 ：一般 是 ?mol/L。理想狀態(tài)是 以 最低引物量 滿足對(duì) 產(chǎn)物擴(kuò)增的最大需要 引物濃度偏高： 引起錯(cuò)配等，致 反應(yīng) 特異性 下降 增加引物間 二聚體 的形成機(jī)會(huì)，降低擴(kuò)增效率 引物間互補(bǔ) 形成 引物二聚體 引物內(nèi)互補(bǔ) 形成 二級(jí)結(jié)構(gòu) ? 序列應(yīng)針對(duì) 靶基因的高度保守區(qū)（ 最特異的區(qū) ） 同時(shí)與非擴(kuò)增區(qū)無同源序列（ 以減少非特異結(jié)合） ? 引物長度 以 1830nt為宜，多為 2024nt ? ATGC最好 隨機(jī)分布（ 避免 5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的 成串排列，尤其 3′ 端不應(yīng)超過 3個(gè)連續(xù)的 G或 C） ? G+C占 4555% （ G+C太少擴(kuò)增效果不佳， G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶 ） ? 兩引物之間： 匹配的 GC含量 （ why? ） 引物設(shè)計(jì)原則（ 1） 引物設(shè)計(jì)原則（ 2） ? 引物內(nèi)部 無 互補(bǔ)序列，避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu) ? 兩 引物間 無 互補(bǔ)序列，避免形成引物二聚體 ? 引物 3’ 端為 關(guān)鍵堿基 ,其第 1和 2個(gè)堿基要嚴(yán)格配對(duì)，否則致 PCR失敗或擴(kuò)增效率和特異性降低 ? 5’ 端無嚴(yán)格限制 ，其堿基可不與模板 DNA互補(bǔ)而呈 游離狀態(tài) ，因此可在其外設(shè)計(jì) 附加序列 （ 見后 ,便于對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的分析和克隆 )，其對(duì) PCR反應(yīng)無明顯影響 3’ 5’ 3’ 5’ 限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列 啟動(dòng)子序列 引入定點(diǎn)突變序列 探針標(biāo)記 (讓引物中的核苷酸帶標(biāo)記） 4） dNTP的質(zhì)量與濃度 （ 1） dNTP呈顆粒狀：保存不當(dāng)易變性失活 （ 2） dNTP溶液呈酸性： 先配成高濃度、 小量分裝， 20℃ 凍存 （ 以 1M NaOH或 1M TrisHCl的緩沖液將其 pH調(diào)節(jié)到 ～ ） 多次凍融會(huì)使 dNTP降解 （ 3） 濃度： 取決于 擴(kuò)增片段的長度 (920200mol/L) 濃度過高易產(chǎn)生 錯(cuò)誤 堿基的摻入，濃度過低則 降低反應(yīng)產(chǎn)量 （ 4） 四種 dNTP濃度 應(yīng)相等 任何一種 dNTP濃度不同于其它時(shí) ,容易引起錯(cuò)配 Mg2+是 DNA聚合酶的 激活劑 * *[Mg2+]過低和過高 → Taq酶活性降低 、 特異性降低 → PCR產(chǎn)物數(shù)量 和 質(zhì)量下降 5） Mg2+ 6）循環(huán)參數(shù)（ 溫度、時(shí)間和次數(shù)） 的設(shè)置 ① 變性溫度與時(shí)間 通常用 93～ 94℃ x l min 或 95℃ x 20 30sec ? 若低于 93℃ ，則需延長時(shí)間 ? 溫度不能過高，否則降低酶的活性 ? 由于模板 DNA鏈比較長，因此 PCR反應(yīng)的 第一個(gè)循環(huán)的變性時(shí)間 需要長些 變性溫度低 會(huì)致 解鏈不完全， 是終致 PCR失敗的最主要原因 ② 退火 (復(fù)性 )溫度與時(shí)間 ? 退火溫度與時(shí)間：取決于 ① 引物（ 長度、堿基組成及其濃度 ） ② 靶基因（ 長度 ） 對(duì)于 20個(gè)核苷酸、 G+C含量約 50%的引物， 55℃ 作為選擇最適退火溫度的 起點(diǎn) 較為理想 ? 退火溫度是 影響 PCR特異性 的重要因素 ↓ 溫度 ： ↑ 反應(yīng)的靈敏性，但會(huì) ↓ 反應(yīng)的特異性 ↑ 溫度 ： ↑ 擴(kuò)增的特異性，同時(shí) ↓ 反應(yīng)的靈敏性 （ WHY？？？ ) 雜交嚴(yán)格度 引物的復(fù)性溫度 通過以下公式幫助計(jì)算和選擇合適的溫度 ? 復(fù)性溫度 =Tm（ 5～ 10℃ ） “Tm=4 （ G+C）＋ 2（ A+T）” 在 Tm值允許范圍內(nèi)，選擇 較高的復(fù)性溫度 可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合， 提高 PCR反應(yīng)的 特異性 復(fù)性時(shí)間 ： 30～ 60sec，足以完成引物與模板之間的完全結(jié)合 ③ 延伸溫度與時(shí)間 ? Taq DNA聚合酶催化 DNA聚合的速度 75～ 80℃ 150nt /sec/酶分子 70℃ 60nt /sec/ 酶分子 55℃ 24nt/sec/ 酶分子 90℃ 時(shí)， DNA合成幾乎不能進(jìn)行 ③ 延伸溫度與時(shí)間 ? 延伸溫度： 70～ 75℃ 既要 考慮其對(duì)酶活性的影響 還要 考慮引物與模板的結(jié)合 ? 常用溫度為 72℃ ? 過高的延伸溫度影響酶活性，也不利于引物和模板的結(jié)合 ③ 延伸溫度與時(shí)間 ? 延伸時(shí)間： 根據(jù) 待擴(kuò)增片段的 長度 而定 ? 1kb的 DNA片段， 1min足夠 ? 3～ 4kb的靶序列需 3～ 4min ? 擴(kuò)增 10kb則需延伸至 15min 延伸時(shí)間過長 會(huì)導(dǎo)致 非特異性擴(kuò)增 **對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間可適當(dāng)延長 6）循環(huán)參數(shù)（溫度、時(shí)間和次數(shù)）的設(shè)置 ? 標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用 三溫度點(diǎn)法 雙鏈 DNA在 90～ 95℃ 變性 再迅速冷卻至 40～ 60℃ 退火 然后快速升溫至 70～ 75℃ 延伸 ? 對(duì)于較短靶基因（長度為 100～ 300bp時(shí)） 可采用 二溫度點(diǎn)法 ,即將退火與延伸溫度合二為一，多采用 94℃ 變性， 65℃ 左右退火與延伸 ④循環(huán)次數(shù) ? 決定著 PCR擴(kuò)增程度 ? 主要取決于模板 DNA的 濃度 和對(duì)產(chǎn)物的 需求量 ? 30次左右 ** 循環(huán)次數(shù)太多，則擴(kuò)增 效率降低 同時(shí)， 錯(cuò)配 和 非特異性產(chǎn)物 的量也隨之增多 25 PCR產(chǎn)物片段及其累積過程 1） PCR產(chǎn)物：可分為 長產(chǎn)物片段 和 短產(chǎn)物片段 ，是由于引物所結(jié)合的模板不一樣所致 ? 短產(chǎn)物片段 的長度嚴(yán)格限定在 2個(gè)引物鏈的 5’端之間，是需要擴(kuò)增的特定片段，以指數(shù)形式擴(kuò)增 (2n) ? 長產(chǎn)物片段 ：比兩引物限定區(qū)更長的延伸產(chǎn)物，是以原始模板 DNA為模板的擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，以倍數(shù)形式擴(kuò)增 (2*n)動(dòng)畫里可見 自學(xué)長、短產(chǎn)物片段 （ 1） 基準(zhǔn)期： 一般為 115個(gè) PCR反應(yīng)周期 ， 該階段 PCR產(chǎn)物的增加較 緩慢 （ 2）指數(shù)增長期： 一般為 1525個(gè)循環(huán)時(shí)，該階段 PCR產(chǎn)物的 增加最為明顯 ， 與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系 2） PCR產(chǎn)物的積累過程：分為三個(gè)時(shí)期 （ 3） 平臺(tái)期： 一般在 25個(gè)循環(huán)以后 ， PCR產(chǎn)物的增加又變得 很緩慢 ， 同時(shí)該期 非特異性擴(kuò)增和錯(cuò)配也明顯增多 引起 平臺(tái)效應(yīng) 的因素 ? dNTPs或引物等消耗殆盡 ? TaqDNA聚合酶活性逐漸降低 ? PCR產(chǎn)物之間、反應(yīng)產(chǎn)物與模板之間的雜交 明智之舉： 選擇合理的循環(huán)次數(shù) ，既能 得到足夠量的 PCR產(chǎn)物， 又可 避免循環(huán)次數(shù)過多帶來的不利 根據(jù) 擴(kuò)增目的 采取相應(yīng)的分析方法 1）鑒定產(chǎn)物的有無及片段大小 ：電泳分析 2）推測(cè)模板的量：如 RTPCR,熒光定量 PCR（后詳） 3）檢測(cè)基因結(jié)構(gòu)的改變 （突變、重排、缺失等） ① DNA測(cè)序 ②雜交分析： Sblot、 班點(diǎn)雜交 等 ③ PCR限制性片段長度多態(tài)性（ RFLP） ④ PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性（ SSCP) ⑤變性梯度凝膠電泳（ DGGE)— 見“其它技術(shù)” 3 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)與分析 ： 其中的等位基因特異性寡核苷酸技術(shù)（ ASO） 先自學(xué)，最后一講再集中講 1）鑒定產(chǎn)物的有無、多少及片段大?。弘娪痉治? 電泳（ 瓊脂糖凝膠電泳 和 聚丙烯酰