腫瘤的分子診斷ppt課件(編輯修改稿)
2025-05-30 03:35 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 雙鏈 DNA在變性梯度聚丙烯酰胺凝膠中電泳 ，凝膠中自上而下所含變性劑濃度線性增長 ， DNA片段進(jìn)行到變性劑某一濃度 ， 與 DNA變性溫度一致的凝膠位置時 ， DNA發(fā)生部分解鏈 ， 電泳遷移率下降 ， 但解鏈的 DNA鏈中有一個堿基改變時 ，會在不同時間解鏈 ， 則因影響電泳速度變化的程度而被分離 。 在 DGGE基礎(chǔ)上，又發(fā)展了用溫度梯度代替化學(xué)變性劑的 TGGE法 （ temperature gradient gel electrophoresis,TGGE） ，由于DGGE和 TGGE是利用溫度和梯度凝膠遷移率來檢測，均需專用的電泳裝置。 （ 五 ） 化學(xué)切割錯配法 （ Chemical cleavage of mismatch,CCM） 基本原理： 將待測含 DNA片段與相應(yīng)的野生型DNA片段或 RNA片段混合變性雜交，在異源雜合的雙鏈核酸分子中，錯配的 C能被羥胺或哌啶切割，錯配的 T能被四氧化鋨切割，經(jīng)變性凝膠電泳可確定是否存在突變。 該法檢出率很高，也是檢測片段最長的方法。應(yīng)用熒光檢測系統(tǒng)可增強(qiáng)敏感度。該法中的化學(xué)試劑有毒，故又發(fā)展了碳化二亞胺檢測法（ Carbodiimide，CDI）， CDI為無毒物質(zhì)。 （六）等位基因特異性寡核苷酸分析法 (allelespecific oligonucleotide ASO) 設(shè)計一段 20bp左右的寡核苷酸片段，其中包含了發(fā)生突變的部位，以此為探針，與固定在膜上的經(jīng) PCR擴(kuò)增的樣品DNA雜交。 可以選用各種突變類型的寡核苷酸探針，同時以野生型探針為對照，如出現(xiàn)陽性雜交帶，則表示樣品中存在與該ASO探針相應(yīng)的點突變。 （七） DNA芯片技術(shù) （ DNA Chip） 基本原理： 將許多已知序列的寡核苷酸 DNA排列在一塊固體材料如玻璃片、硅片（集成電路板）上，彼此之間重疊一個堿基，并覆蓋所需測定的基因，將熒光標(biāo)記的正常 DNA和突變 DNA分別與兩塊DNA芯片雜交，由于至少存在一個堿基的差異，正常和突變的 DNA將會得到不同的雜交圖譜，經(jīng)過共聚焦顯微鏡分別檢測兩種 DNA分子產(chǎn)生的熒光信號，即可確定是否存在突變。 可用于基因定位 、 DNA測序 、 物理圖譜和遺傳圖譜的構(gòu)建等 ， 在基因突變檢測方面 DNA芯片也有廣闊的前景 。 （ 八 ） RNA酶 A切割法 制備 RNA探針，與待測 DNA或 RNA片段雜交，在一定條件下，異源雙鏈核酸分子 RNA ： RNA或 RNA ： DNA的錯配堿基可被 RNase A切割，切割產(chǎn)物可通過變性凝膠電泳分離。 該法可用于 12kb的大片段進(jìn)行檢測，并能確定突變位點。 （ 九 ） 染色體分析 （ analysis of chromosome） 熒光原位雜交技術(shù) （ FISH） 寡核苷酸引物原位 DNA合成技術(shù) （ Oligonncleotide primed in situ DNA synthesis, PRINS） 重復(fù)引物原位標(biāo)記技術(shù) （ repeated PRINS） 多色原位引物標(biāo)記 （ multicolor PRINS） 比較基因組雜交 （ parative genomic hybridization, CGH） 基本原理： 用不同的非同位素標(biāo)記物，分別標(biāo)記被檢測的基因組 DNA（常為腫瘤 DNA）和正常人基因組 DNA，兩者以 1： 1混合后制備探針，共同與正常人中期染色體標(biāo)本進(jìn)行染色體原位抑制雜交，雜交后對不同熒光物分別進(jìn)行檢測，以每條染色體長軸各位點的被測 DNA與正常基因組 DNA熒光強(qiáng)度比，反映兩組 DNA不同序列的拷貝數(shù)。 只能檢測腫瘤基因組中相對于正?；蚪M平均拷貝數(shù)的變化，而不能檢測易位、倒位及其它拷貝數(shù)沒有變化的染色體畸變，基因重排和點突變，也不能檢出小于 2Mb的缺失。 （ 十 ） DNA序列分析 （ DNA sequencing） 應(yīng)用各種突變檢測技術(shù)檢測到的基因突變，最后都需要用 DNA序列分析才能確定突變的類型及突變的位置 。 直接測序法 （ direct sequencing， DS） PCR循環(huán)測序法 雙脫氧終止法 基本原理 第三節(jié) 限制性酶切片段長度多態(tài)性分析 一 、 等位基因不平衡 應(yīng)用同一腫瘤的正常體細(xì)胞 （ 常分為血細(xì)胞或腫瘤旁正常組織 ） 和腫瘤細(xì)胞的DNA， 檢測 DNA多態(tài)性座位上等位基因不平衡性 。 當(dāng)兩個等位基因的相關(guān)性密度在正常與腫瘤細(xì)胞之間出現(xiàn)顯著性差異時 ，就提示腫瘤細(xì)胞中多態(tài)序列座位處出現(xiàn)突變 。 限制性片段長度多態(tài)性 （ restriction fragment len
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1