實(shí)驗(yàn)四pcr技術(shù)在動(dòng)物傳染病診斷中的作用(編輯修改稿)
2025-02-02 02:39 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 l/L的 EDTA螯合 Mg2+ 。 (3) 99100℃ 加熱 10min。 目前已有直接純化 PCR產(chǎn)物的裝備可用。 PCR反應(yīng)體系 — TaqDNA聚合酶滅活方法 緩沖液一般含 1050mmol/L TrisCl (20℃ 下 ), 50mmol/L KCl和適當(dāng)濃度的 Mg2+ 。 TrisCl在 20℃時(shí) pH為 ，但在實(shí)際 PCR反應(yīng)中， pH為 。50mmol/L的 KCl有利于引物的退火 。另外，反應(yīng)液可加入5mmol/L的 二硫蘇糖醇 (DDT)或 100μg/ml 的 牛血清白蛋白(BSA)，它們可穩(wěn)定酶活性， 另外加入 T4噬菌體的基因 32蛋白則對(duì)擴(kuò)增較長(zhǎng)的 DNA片段有利。各種 TaqDNA聚合酶商品都有自己特定的一些緩沖液。 PCR反應(yīng)體系 — PCR反應(yīng)緩沖液 PCR的基本反應(yīng)步驟 變性 94℃ 延伸 72 ℃ 退火 Tm5℃ 包括三個(gè)基本步驟 : (1)變性 (使改變本性 ):目的雙鏈 DNA片段在 94℃ 下解鏈 。 (2)退火 (退火 ):兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度 (50℃ 左右 )下與模板上的目的序列通過(guò)氫鍵配對(duì) 。 (3)延伸 (延長(zhǎng) ): DNA模板 —引物結(jié)合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以 dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板 DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)變性 退火 延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“ 半保留復(fù)制鏈 ” ，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需 2～ 4分鐘， 2～ 3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。 PCR的基本反應(yīng)步驟 ?在第一輪循環(huán)前，在 94℃ 下變性 510min非常重要，它可使模板 DNA完全解鏈，然后加入 TaqDNA聚合酶 (熱啟動(dòng) )，這樣可減少聚合酶在低溫下仍有活性從而延伸非特異性配對(duì)的引物與模板復(fù)合物所造成的錯(cuò)誤。變性不完全，往往使 PCR失敗。因?yàn)槲醋冃酝耆?DNA雙鏈會(huì)很快復(fù)性，減少 DNA產(chǎn)量。 ?對(duì)于富含 GC的序列，可適當(dāng)提高變性溫度。但變性溫度過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)都會(huì)導(dǎo)致酶活性的損失。 變性 引物退火的溫度和所需時(shí)間的長(zhǎng)短取決于引物的堿基組成，引物的長(zhǎng)度、引物與模板的配對(duì)程度以及引物的濃度。實(shí)際使用的退火溫度比擴(kuò)增引物的 Tm值約低 5℃ 。 一般當(dāng)引物中 GC含量高，長(zhǎng)度長(zhǎng)并與模板完全配對(duì)時(shí)，應(yīng)提高退火溫度。退火溫度越高，所得產(chǎn)物的特異性越高 。有些反應(yīng)甚至可將退火與延伸兩步合并，只用兩種溫度 (例如用 60℃ 和 94℃) 完成整個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，既省時(shí)間又提高了特異性。 退火 延伸反應(yīng)通常為 72℃ ，接近于 TaqDNA聚合酶的最適反應(yīng)溫度 75℃ 。 實(shí)際上，引物延伸在退火時(shí)即已開(kāi)始，因?yàn)門aqDNA聚合酶的作用溫度范圍可從 20℃ 85℃ 。 延伸反應(yīng)時(shí)間的長(zhǎng)短取決于目的序列的長(zhǎng)度和濃度。在一般反應(yīng)體系中，TaqDNA聚合酶每分鐘約可合成 2kb長(zhǎng)的 DNA。 延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加。但對(duì)很低濃度的目的序列，則可適當(dāng)增加延伸反應(yīng)的時(shí)間。 一般在擴(kuò)增反應(yīng)完成后，都需要一步較長(zhǎng)時(shí)間 (1030min)的延伸反應(yīng) ，以獲得盡可能完整的產(chǎn)物，這對(duì)以后進(jìn)行克隆或測(cè)序反應(yīng)尤為重要。 延伸 當(dāng)其它參數(shù)確定之后，循環(huán)次數(shù)主要取決于 DNA濃度。一般而言 2530輪循環(huán)已經(jīng)足夠。 循環(huán)次數(shù)過(guò)多，會(huì)使 PCR產(chǎn)物中非特異性產(chǎn)物大量增加。 通常經(jīng) 2530輪循環(huán)擴(kuò)增后，反應(yīng)中 TaqDNA聚合酶已經(jīng)不足，如果此時(shí)產(chǎn)
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