實驗四pcr技術(shù)在動物傳染病診斷中的作用(編輯修改稿)
2025-02-02 02:39 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 l/L的 EDTA螯合 Mg2+ 。 (3) 99100℃ 加熱 10min。 目前已有直接純化 PCR產(chǎn)物的裝備可用。 PCR反應(yīng)體系 — TaqDNA聚合酶滅活方法 緩沖液一般含 1050mmol/L TrisCl (20℃ 下 ), 50mmol/L KCl和適當(dāng)濃度的 Mg2+ 。 TrisCl在 20℃時 pH為 ，但在實際 PCR反應(yīng)中， pH為 。50mmol/L的 KCl有利于引物的退火 。另外，反應(yīng)液可加入5mmol/L的 二硫蘇糖醇 (DDT)或 100μg/ml 的 牛血清白蛋白(BSA)，它們可穩(wěn)定酶活性， 另外加入 T4噬菌體的基因 32蛋白則對擴(kuò)增較長的 DNA片段有利。各種 TaqDNA聚合酶商品都有自己特定的一些緩沖液。 PCR反應(yīng)體系 — PCR反應(yīng)緩沖液 PCR的基本反應(yīng)步驟 變性 94℃ 延伸 72 ℃ 退火 Tm5℃ 包括三個基本步驟 : (1)變性 (使改變本性 ):目的雙鏈 DNA片段在 94℃ 下解鏈 。 (2)退火 (退火 ):兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度 (50℃ 左右 )下與模板上的目的序列通過氫鍵配對 。 (3)延伸 (延長 ): DNA模板 —引物結(jié)合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以 dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板 DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)變性 退火 延伸三過程，就可獲得更多的“ 半保留復(fù)制鏈 ” ，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需 2～ 4分鐘， 2～ 3小時就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。 PCR的基本反應(yīng)步驟 ?在第一輪循環(huán)前，在 94℃ 下變性 510min非常重要，它可使模板 DNA完全解鏈，然后加入 TaqDNA聚合酶 (熱啟動 )，這樣可減少聚合酶在低溫下仍有活性從而延伸非特異性配對的引物與模板復(fù)合物所造成的錯誤。變性不完全，往往使 PCR失敗。因為未變性完全的 DNA雙鏈會很快復(fù)性，減少 DNA產(chǎn)量。 ?對于富含 GC的序列，可適當(dāng)提高變性溫度。但變性溫度過高或時間過長都會導(dǎo)致酶活性的損失。 變性 引物退火的溫度和所需時間的長短取決于引物的堿基組成，引物的長度、引物與模板的配對程度以及引物的濃度。實際使用的退火溫度比擴(kuò)增引物的 Tm值約低 5℃ 。 一般當(dāng)引物中 GC含量高，長度長并與模板完全配對時，應(yīng)提高退火溫度。退火溫度越高，所得產(chǎn)物的特異性越高 。有些反應(yīng)甚至可將退火與延伸兩步合并，只用兩種溫度 (例如用 60℃ 和 94℃) 完成整個擴(kuò)增循環(huán)，既省時間又提高了特異性。 退火 延伸反應(yīng)通常為 72℃ ，接近于 TaqDNA聚合酶的最適反應(yīng)溫度 75℃ 。 實際上，引物延伸在退火時即已開始，因為TaqDNA聚合酶的作用溫度范圍可從 20℃ 85℃ 。 延伸反應(yīng)時間的長短取決于目的序列的長度和濃度。在一般反應(yīng)體系中，TaqDNA聚合酶每分鐘約可合成 2kb長的 DNA。 延伸時間過長會導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加。但對很低濃度的目的序列，則可適當(dāng)增加延伸反應(yīng)的時間。 一般在擴(kuò)增反應(yīng)完成后，都需要一步較長時間 (1030min)的延伸反應(yīng) ，以獲得盡可能完整的產(chǎn)物，這對以后進(jìn)行克隆或測序反應(yīng)尤為重要。 延伸 當(dāng)其它參數(shù)確定之后，循環(huán)次數(shù)主要取決于 DNA濃度。一般而言 2530輪循環(huán)已經(jīng)足夠。 循環(huán)次數(shù)過多，會使 PCR產(chǎn)物中非特異性產(chǎn)物大量增加。 通常經(jīng) 2530輪循環(huán)擴(kuò)增后，反應(yīng)中 TaqDNA聚合酶已經(jīng)不足，如果此時產(chǎn)
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