【文章內(nèi)容簡介】 循環(huán)條件 假陰性的原因 —— 模板 模板中含有雜蛋白質(zhì) 模板中含有 Taq酶抑制劑 模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白 在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚 模板核酸變性不徹底 假陰性的原因 —— 酶失活 酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。 需注意的是有時忘加 Taq酶或溴乙錠 假陰性的原因 —— 引物 引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是 PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。 選定一個好的引物合成單位 引物的濃度不僅要看 OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致 引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效 引物設(shè)計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。 假陰性的原因 —— Mg2+濃度 Mg2+ 濃度對 PCR擴增效率影響很大 濃度過高可降低 PCR擴增的特異性 濃度過低則影響 PCR擴增產(chǎn)量甚至使 PCR擴增失敗而不出擴增條帶 。 假陰性的原因 —— 反應(yīng)體積的改變 通常進行 PCR擴增采用的體積為 20ul、30ul、 50ul或 100ul， 應(yīng)用多大體積進行PCR擴增 ， 是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定 ， 在做小體積如 20ul后 ， 再做大體積時 ， 一定要模索條件 ， 否則容易失敗 。 假陰性的原因 —— 物理原因 變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性 退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率 退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低 PCR擴增效率 用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計檢測一下擴增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是 PCR失敗的原因之一 假陰性的原因 —— 靶序列變異 靶序列發(fā)生突變或缺失 ， 影響引物與模板特異性結(jié)合 靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列 ， 其 PCR擴增是不會成功的 假陽性 所有樣品均為陽性 引物設(shè)計不合適 靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染 假陽性的原因 —— 引物設(shè)計不合適 選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行 PCR擴增時，擴增出的 PCR產(chǎn)物為非目的性的序列 靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性 需重新設(shè)計引物 假陽性的原因 —— 靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染 整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決： 操作時應(yīng)小心輕放，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外 除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應(yīng)一次性使用 必要時，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。 假陽性的原因 —— 靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染 空氣中的小片段核酸污染 ， 這些小片段比靶序列短 ， 但有一定的同源性 。 與引物互補后 ， 可擴增出 PCR產(chǎn)物 ， 而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生 出現(xiàn)非特異性擴增帶 PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶 出現(xiàn)非特異性擴增帶的原因 引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體 Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān) 酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。 出現(xiàn)非特異性擴增帶采取的對策 必要時重新設(shè)計引物 減低酶量或調(diào)換另一來源的酶 降低引物量 ， 適當(dāng)增加模板量 ， 減少循環(huán)次數(shù) 適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃ 變性 ， 65℃ 左右退火與延伸 )。 出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶 PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶 出現(xiàn)片狀拖帶的原因 酶量過多或酶的質(zhì)量差 dNTP濃度過高 Mg2+濃度過高 退火溫度過低 循環(huán)次數(shù)過多 出現(xiàn)片狀拖帶的對策 減少酶量 ， 或調(diào)換另一來源的酶 減少 dNTP的濃度 適當(dāng)降低 Mg2+濃度 增加模板量 減少循環(huán)次數(shù) 。 污染原因 標(biāo)本間交叉污染 標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染 標(biāo)本放置時，由于密封不嚴(yán)溢于容器外 容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染 標(biāo)本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染 有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣體擴散，導(dǎo)致彼此間的污染 . 污染原因 PCR試劑的污染 主要是由于在 PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染 . 污染原因 PCR擴增產(chǎn)物污染，這是 PCR反應(yīng)中最主要最常見的污染問題 因為 PCR產(chǎn)物拷貝量大 (一般為 1013拷貝 /ml)，遠遠高于 PCR檢測數(shù)個拷貝的極限，所以極微量的 PCR產(chǎn)物污染，就可形成假陽性 還有一種容易忽視，最可能造成 PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染；在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應(yīng)管，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計算一個氣溶膠顆?？珊?48000拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題 污染原因 實驗室中克隆質(zhì)粒的污染 在分子生物學(xué)實驗室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對照的檢驗室 ， 這個問題也比較常見 。因為克隆質(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高 ，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑 ，而且在活細胞內(nèi)的質(zhì)粒 ， 由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力 ， 其污染可能性也很大 污染的監(jiān)測 一個好的實驗室，要時刻注意污染的監(jiān)測，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染 . 陽性對照 陰性對照 重復(fù)性試驗 選擇不同區(qū)域的引物進行 PCR擴增 陽性對照 在建立 PCR反應(yīng)實驗室及一般的檢驗單位都應(yīng)設(shè)有 PCR陽性對照 ， 它是 PCR反應(yīng)是否成功 、 產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標(biāo)志 。 陽性對照要選擇擴增度中等 ， 重復(fù)性好 ， 經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本 如以重組質(zhì)粒為陽性對照 ， 其含量宜低不宜高(100個拷貝以下 )。 但陽性對照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽性標(biāo)本 ， 其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大 。 因而當(dāng)某一 PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定 ， 檢驗人員心中有數(shù)時 ， 在以后的實驗中可免設(shè)陽性對照 . 陰性對照 每次 PCR實驗務(wù)必做陰性對照 標(biāo)本對照 :被檢的標(biāo)本是血清就用鑒定后的正常血清作對照 。被檢的標(biāo)本是組織細胞就用相應(yīng)的組織細胞作對照 . 試劑對照 :在 PCR試劑中不加模板 DNA或RNA，進行 PCR擴增，以監(jiān)測試劑是否污染 . 防止污染的方法 合理分隔實驗室 :將樣品的處理、配制、 PCR反應(yīng)液、 PCR循環(huán)擴增及 PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進行，特別注意樣本處理及 PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴(yán)格分開 . 最好能劃分①標(biāo)本處理區(qū)；② PCR反應(yīng)液制備區(qū)；③ PCR循環(huán)擴增區(qū)；④ PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)。 實驗用品及吸樣槍應(yīng)專用 實驗前應(yīng)將實驗室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或 RNA 防止污染的方法 吸樣槍：吸樣槍污染是一個值得注意的問題。由于操作時不慎將樣品或模板核酸吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個嚴(yán)重的污染源，因而加樣或吸取模板核酸時要十分小心，吸樣要慢，吸樣時盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染 防止污染的方法 預(yù)混和分裝 PCR試劑：所有的 PCR試劑都應(yīng)小量分裝 ， 如有可能 ， PCR反應(yīng)液應(yīng)預(yù)先配制好 ， 然后小量分裝 ， 20℃ 保存 .以減少重復(fù)加樣次數(shù) ， 避免污染機會 . PCR試劑 ， PCR反應(yīng)液應(yīng)與樣品及 PCR產(chǎn)物分開保存 ， 不應(yīng)放于同一冰盒或同一冰箱 防止污染的方法 防止操作人員污染 ， 使用一次性手套 、吸頭 、 小離心管應(yīng)一次性使用 . 設(shè)立適當(dāng)?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ?， 陽性對照以能出現(xiàn)擴增條帶的最低量的標(biāo)準(zhǔn)病原體核酸為宜 ， 并注意交叉污染的可能性 ， 每次反應(yīng)都應(yīng)有一管不加模板的試劑對照及相應(yīng)不含有被擴增核酸的樣品作陰性對照 防止污染的方法 減少 PCR循環(huán)次數(shù) ， 只要 PCR產(chǎn)物達到檢測水平就適可而止 . 選擇質(zhì)量好的 Eppendorf管 ， 以避免樣本外溢及外來核酸的進入 ， 打開離心管前應(yīng)先離心 ， 將管壁及管蓋上的液體甩至管底部 。 開管動作要輕 ， 以防管內(nèi)液體濺出 . 第三節(jié) PCR技術(shù)的分類 正常 PCR 巢式 PCR 復(fù)合 PCR 不對稱 PCR 反轉(zhuǎn)錄 PCR 反向 PCR 錨定 PCR 原位 PCR 免疫 PCR 彩色 PCR 修飾引物 PCR 固著 PCR 膜結(jié)合 PCR 重組 PCR 正常 PCR（ Normal PCR） 一般的 DNA模板采用一對引物，經(jīng) 30輪左右循環(huán)擴增，即可達到預(yù)期的目的 常用于多拷貝 DNA分子的擴增 PCR產(chǎn)物的檢測： 瓊脂糖凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳 返回 巢式 PCR（ Nested PCR） 先用一對引物對模板進行擴增，取出第一次 PCR產(chǎn)物，然后再用另一對引物擴增第一次 PCR產(chǎn)物 第一次 PCR 第二次 PCR 外引物（ outerprimer） 內(nèi)引物（ interprimer） 分類 半巢式 PCR 中途進退式 PCR 半巢式 PCR Seminested PCR 只有一個外引物對模板進行擴增，取出第一次 PCR產(chǎn)物，然后用另一對內(nèi)引物擴增 PCR產(chǎn)物 中途進退式 PCR Dropin Dropout PCR 外引物設(shè)計得比內(nèi)引物長一些 ， 且用量較少 ，同時在第一次