pcr技術(shù)的種類及應(yīng)用資料(編輯修改稿)
2024-08-26 03:56 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 作時(shí)最關(guān)鍵的是目的基因的引物設(shè)計(jì)[17]。基于芯片的PCR技術(shù)主要有兩種模式：一種是試劑在溫度循環(huán)變化的管道區(qū)間中連續(xù)流動(dòng)實(shí)現(xiàn)PCR擴(kuò)增，稱為連續(xù)流動(dòng)PCR微芯片；另一種是試劑不動(dòng)，而芯片腔體的溫度迅速循環(huán)變化實(shí)現(xiàn)PCR擴(kuò)增，稱為PCR微池芯片。前一種方式容易實(shí)現(xiàn)集成化，后一種方式的反應(yīng)速度要比前一種快。根據(jù)不同的需要，可將不同的PCR技術(shù)與芯片結(jié)合，如利用微加工技術(shù)制備的微型PCR芯片[5]、實(shí)時(shí)定量 PCR芯片[9]、熒光定量PCR芯片[17]等。 固相PCR 所謂固相PCR，就是將特定引物寡核苷酸通過不同的方法共價(jià)固定到固相支持物上來擴(kuò)增目標(biāo)DNA。固相支持物有瓊脂糖小珠、乳膠小珠、聚丙烯酰胺小珠、普通玻片、磁珠、硅片等。在固相支持物上固定核酸的方法有兩種，1）將核酸的末端修飾上氨基，比如利用氨基與甲苯磺?；螂禄姆磻?yīng)來固定核酸； 2）將核酸的末端磷酸化修飾，再通過磷酸基團(tuán)與其他功能基團(tuán)結(jié)合將核酸固定在固相支持物表面。容易分離純化PCR產(chǎn)物是固相PCR的主要優(yōu)點(diǎn)。例如用瓊脂糖小珠固定引物與RTPCR相結(jié)合, 就能很方便地構(gòu)建cDNA文庫[12]。圖2 橋式固相PCR原理 （摘自 陶生策等, 2001） 電子PCR 電子PCR( Electronic PCR, ePCR)是一種新概念，主要是用于基因組作圖[12]。 現(xiàn)在已經(jīng)成為常用的核苷酸序列電子分析工具，它在DNA 片段的染色體定位、基因組測(cè)序、基因組輔助作圖、PCR引物輔助設(shè)計(jì)和基因克隆等方面都發(fā)揮著重要的作用[20]。電子PCR技術(shù)是利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫作為平臺(tái)，借助相應(yīng)的分析運(yùn)算軟件，搜索要查詢的DNA序列( query sequence) 是否含有序列標(biāo)記位點(diǎn) ( Sequence Tagged Sit, STS)，并且根據(jù)序列標(biāo)記位點(diǎn)（STS）在已知基因組圖譜的位置將所查詢的DNA 序列在基因組圖譜上進(jìn)行定位[21]。它的原理與BLAST相似，但是BLAST是將所查詢序列與數(shù)據(jù)庫中序列的全長(zhǎng)進(jìn)行比對(duì)，而電子PCR是將所查詢序列與數(shù)據(jù)庫中STS序列兩端的PCR引物序列進(jìn)行比對(duì)。從一定意義上說，電子PCR 是一種不需要具體實(shí)驗(yàn)操作的，并且借助于某些生物信息數(shù)據(jù)和專用分析軟件在計(jì)算機(jī)上進(jìn)行的PCR技術(shù)，而BLAST是類似于電子雜交技術(shù)。 簡(jiǎn)并PCR簡(jiǎn)并PCR是于20世紀(jì)90年代初建立起來的用于細(xì)胞遺傳學(xué)中特異擴(kuò)增DNA的技術(shù)，它根據(jù)密碼子存在的簡(jiǎn)并性設(shè)計(jì)寡核苷酸引物，并進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，由于該P(yáng)CR反應(yīng)不需要知道要擴(kuò)增DNA片段的核苷酸序列，所以該技術(shù)在很多領(lǐng)域都得到廣泛的應(yīng)用。PCR最初是為了擴(kuò)增已知序列設(shè)計(jì)的，簡(jiǎn)并PCR技術(shù)能擴(kuò)增未知的序列。當(dāng)待研究的基因序列不明，僅僅知其一部分蛋白質(zhì)的氨基酸序列，可根據(jù)已知氨基酸序列合成一組簡(jiǎn)并引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)基因家族中的未知基因進(jìn)行分離[15]。要成功的進(jìn)行簡(jiǎn)并PCR的關(guān)鍵是設(shè)計(jì)好兩組引物庫和對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化[10]。 簡(jiǎn)并PCR技術(shù)是尋找和發(fā)現(xiàn)”新”基因和蛋白質(zhì)家族新成員的一種非常有用的工具[15]。 等位基因特異PCR技術(shù) 等位基因特異PCR( Allele specific PCR, ASPCR)的基本原理：根據(jù)SNP 位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物，其中一條鏈(特異鏈)的3，末端與SNP位點(diǎn)的堿基互補(bǔ)或相同，另一條鏈(普通鏈) 按常規(guī)方法進(jìn)行設(shè)計(jì)，因此，ASPCR技術(shù)是一種基于SNP的PCR標(biāo)記。因?yàn)樘禺愐镌谝环N基因型中有擴(kuò)增產(chǎn)物，而在另一種基因型中沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，用凝膠電泳可以很容易地分辨出是否有擴(kuò)增產(chǎn)物，從而確定基因型的SNP。圖3 ASPCR技術(shù)原理（摘自 陳吉寶等. 2005） 原位PCR原位PCR ( In situ polymerase Chain reaction) 就是將PCR技術(shù)的高效擴(kuò)增和原位雜交的細(xì)胞定位結(jié)合起來，從而在組織細(xì)胞中原位檢測(cè)單拷貝或低拷貝的特定的DNA或RNA序列。雖然PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物可以利用凝膠電泳或Southern印記雜交來顯示結(jié)果，PC R對(duì)很多細(xì)胞的靶序列進(jìn)行分析時(shí)，需要破碎細(xì)胞或組織，并且分離出核酸，因此不能將擴(kuò)增結(jié)果直接在組織中定位，所以不能確定靶序列所在的細(xì)胞和細(xì)胞的類型，這是PC R技術(shù)的一個(gè)明顯的局限
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