利用實時定量pcr和2－ct法分析基因相對表達量-生物在(編輯修改稿)
2025-05-01 23:14 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 在任何特定的組織中都存在。. 2－△△CT方法的數(shù)據(jù)分析實時定量PCR所得到CT值可以很容易的輸出到表格程序如Microsoft Excel中去。為了顯示數(shù)據(jù)分析過程，我們在這里給出了一個基因表達定量的實驗數(shù)據(jù)和樣本列表。通過βactin 均一化處理，我們對目標(biāo)基因fosglomyc 的表達變化進行了監(jiān)測。在8h 的時間范圍內(nèi)，在每一時間點都取3 個重復(fù)樣本，每一樣本在cDNA 合成之後都做定量PCR ，數(shù)據(jù)分析用到了公式9，即：Time x 表示任意時間點，Time 0表示經(jīng)β actin 校正后1 倍量的目標(biāo)基因表達。0 時刻目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因的平均CT（見圖2 第8 欄）被用于公式9 中。通過公式9 計算出每一個樣本目標(biāo)基因表達通過β actin 均一化處理後相對于0 時刻的倍數(shù)（見圖2 第9 欄）。平均SD，CV 由每一個時間點所取的三個重復(fù)樣求得。用這種分析方法，在0 時刻的平均倍數(shù)變化接近于1。我們發(fā)現(xiàn)通過檢測在 0 時刻平均倍數(shù)變化是否為1 可以很方便的驗證三個重復(fù)樣品之間是否有錯誤或者誤差。如果得到的結(jié)果與1偏差很大，則表明存在計算錯誤或者是很高的實驗誤差。在前面的例子中，在每一時間點上分別取了三個獨立的 RNA 樣本進行了分析。因此對每一個樣本分別處理，通過計算後取結(jié)果的平均值就非常重要。如果是同一樣本進行 PCR 擴增的重復(fù)，這就需要首先求出平均CT，然後再進行 計算。怎么樣計算平均值就要看目標(biāo)基因和內(nèi)參基因是在同一個管子中擴增還是在不同的管子中擴增。表 1 給出了目標(biāo)基因（c myc ）和內(nèi)參基因（GAPDH ）在不同管中擴增的實驗數(shù)據(jù)。在這里不應(yīng)該把任一單個的 cmyc 管子和 GAPDH 管子作比較，而應(yīng)該分別計算出 cmyc 和 GAPDH 的平均CT 來計算△CT 。重復(fù)實驗中CT值的估計偏差通過標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)計算轉(zhuǎn)化成最後結(jié)果中相對量的變化。但其中的一個難點是 CT值與相應(yīng)的拷貝數(shù)成指數(shù)關(guān)系（見第4 部分），因此，在最後的計算中，的誤差通過△△CT 加上標(biāo)準(zhǔn)偏差和△△CT 減去標(biāo)準(zhǔn)偏差來評估，這就使得求得的數(shù)值相對于平均值呈不對稱分布。不對稱分布是因為結(jié)果經(jīng)指數(shù)處理後轉(zhuǎn)化成量的線性比較造成的。通過不同熒光染料標(biāo)記的探針，我們可以在同一管中同時擴增目標(biāo)序列和內(nèi)標(biāo)序列。表2 給出了目標(biāo)基因（c myc）和內(nèi)標(biāo)基因（GAPDH）在同一管中擴增的實驗數(shù)據(jù)。對于任意一個管子，目標(biāo)基因（c myc）和內(nèi)參基因（GAPDH）擴增時加入的cDNA 量都是一樣多的，所以可以分別對每個管子計算△CT 值，這些值取平均后再進行計算。 在這里估計誤差值也是一個不對稱的范圍，反映了誤差經(jīng)指數(shù)處理轉(zhuǎn)化為線性差異。在表1 和表2 中，估計誤差在從△CT 到△△CT 的計算中未見有增加，這是因為我們把參照基因和檢測基因的誤差都顯示出來了。我們把△CT，cb 當(dāng)作一個人為設(shè)定的常數(shù)來減去，得到△△CT 。這樣得到的結(jié)果就與圖 2 所顯示的在求平均之前對不同重復(fù)樣本分別通過各自的CT 值求實 所得結(jié)果 相當(dāng)。另一種方法是將參照基因當(dāng)作沒有任何誤差的1倍的量，在這種情況下，平均△CT,cb 的誤差值被引入到每一樣本的△△CT中。在表1中，腎臟中△△CT 變成 177。 而經(jīng)過校正的cmyc 倍， 到 。而在大腦中的結(jié)果是沒有誤差的1倍。2. 2－△Cf方法. 2－△Cf方法的推導(dǎo)通過內(nèi)標(biāo)
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