利用小隨體多重pcr和帶型分析鑒別釀酒酵母菌株(編輯修改稿)
2025-07-13 23:13 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 10分鐘。去上清， 70% (v/v)乙醇純化，45攝氏度下真空干燥。得到的DNA溶于15mlTE (10 mmol L_1 Tris, 1 mmol L_1 EDTA, pH )。第二步檢驗(yàn)該方法適用性的過(guò)程中。 .PCR與電泳三個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，SC8132X,YOR267C和SCPTSY7被使用是由于他們具有高度的多態(tài)性。擴(kuò)增是依賴(lài)于幾對(duì)特異性的順式與反式的引物進(jìn)行的（見(jiàn)表二）SC8132X位點(diǎn)的引物與YOR267C位點(diǎn)的順式引物是由Field和Wills所設(shè)計(jì)的，YOR267C位點(diǎn)的反式引物是由Gonzalez Techera et al制作的，而SCPTSY7位點(diǎn)的順式引物是由Perez et al制作的。SCPTSY7位點(diǎn)的反式引物是由我們使用免費(fèi)軟件Primer 3所設(shè)計(jì)的，目的是使其產(chǎn)生幾個(gè)電泳帶具有明顯位置區(qū)別的擴(kuò)增子而不與其他兩個(gè)位點(diǎn)重疊。PCR擴(kuò)增是進(jìn)行在一個(gè)具有20微升體積液體的Biorad MyCycler熱力周期儀中。20微升液體是有以下部分組成的：1微升DNA的萃取溶液（包含2040ng DNA），,2微升去鎂的PCR緩沖液，2個(gè)單位Taq DNA聚合酶，SCYOR267C位點(diǎn)引物各10pmol，SC8132X位點(diǎn)引物各15pmol以及SCPTSY7位點(diǎn)的引物各40pmol。PCR反應(yīng)組分各成分的濃度被設(shè)計(jì)得盡量減小非特異性擴(kuò)增。在發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，反應(yīng)體系的體積為10微升，試劑組分與所占比例與上述反應(yīng)體系相同，這樣做可以節(jié)省Taq聚合酶與其他昂貴的試劑。為了優(yōu)化對(duì)三個(gè)位點(diǎn)的多元化擴(kuò)增，方案如下：94℃保持4分鐘，℃保持30秒?！姹３?5秒?！姹３?0秒為一個(gè)周期，重復(fù)28個(gè)周期，最后以72℃保持10分鐘處理。將產(chǎn)物在尺寸為15*%（w/v）的瓊脂糖凝膠上，浸于TBE緩沖液中，在100V條件下電泳80分鐘，凝膠將被溴化乙錠所染色。當(dāng)使用聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，*%(w/v)的TBE凝膠，在100V條件下電泳60分鐘。Marker應(yīng)使用標(biāo)記分子量為10020bp的Sigma低階marker。電泳分布情況被集群分析軟件處理，該軟件使用一種類(lèi)似于二進(jìn)制的指標(biāo)，它使用UPGMA的方式創(chuàng)建系統(tǒng)樹(shù)圖。同表象相關(guān)性將被用于探知由Rossetti和Giraffa描述的確定的與非確定的聚類(lèi)。同表項(xiàng)相關(guān)性的百分比在各個(gè)分支中給出。通過(guò)對(duì)每個(gè)菌株取五份菌落DNA萃取液進(jìn)行擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)可重復(fù)性，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的分析是將其分為五個(gè)不同孔道進(jìn)行瓊脂糖電泳而進(jìn)行的。為了檢驗(yàn)微衛(wèi)星標(biāo)記在酒精發(fā)酵中的穩(wěn)定性，檢驗(yàn)是在隨意挑選的三個(gè)菌株中進(jìn)行的：菌株2，菌株3和菌株5。再水化后，每個(gè)菌株被單獨(dú)接種在盛有滅菌葡萄汁的500ml燒瓶中。在16℃的條件下發(fā)酵20天。表二 用于擴(kuò)增的三株啤酒酵母微衛(wèi)星位點(diǎn)引物分析在十組隨意選出的菌落中進(jìn)行，這些菌落取自發(fā)酵開(kāi)始時(shí)和結(jié)束時(shí)的每個(gè)菌株。兩株酵母菌株，DSM Cepage Chardonnay和Vitilevure DV10被選中進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，因?yàn)樗麄兙哂邢嗨频挠猛九c特征（用于白葡萄發(fā)酵，醇耐受性和表型殺傷性相似），就像制造者說(shuō)的一樣。Vitilevure DV10是耐冷的。滅菌的葡萄汁被用于培養(yǎng)基。它包含濃度均為150mg/L的硫酸銨和磷酸銨作為發(fā)酵氮源。濃度為200g/L的蔗糖被加入作為糖源。這個(gè)儀器以一個(gè)有孔的橡皮塞封口，有一根以棉線(xiàn)固定的巴斯德吸管插在孔中。以單菌株涂平板，再挑出單菌落以多元的PCR分析方法檢測(cè)它們的同一性。然后將相同的菌落懸浮培養(yǎng)于預(yù)配的培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基由滅
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