【正文】 引物設(shè)計是否合理，是決定 PCR反應(yīng)成敗的關(guān)鍵。（如：沒有多聚嘌呤或多聚嘧啶序列，并且沒有二核苷酸重復(fù)序列） 長度 引物中與模板互補的區(qū)域應(yīng)該 18～ 25個核苷酸長度。 重復(fù)和自身互補序列 不能有大于 3bp的反向重復(fù)序列（回文序列）或自身互補序列存在。尤其在引物 3‘端。因為在 PCR中引物的濃度往往是比較高，所以即使引物間微弱的互補，都會導(dǎo)致引物間形成雜交，隨后是引物二聚體的形成和擴(kuò)增。精心進(jìn)行引物設(shè)計，應(yīng)用熱啟動 PCR或降落 PCR或特制的 DNA聚合酶 ,都可以抑制引物二聚體的形成。 特 性 優(yōu) 化 設(shè) 計 3’末端 3’末端的性質(zhì)非常關(guān)鍵。然而，并不推薦使用 3‘末端有 …... NNCG或 ..... NNGC序列的引物，因為末端 GC堿基高的自由能可以促進(jìn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成，還可能產(chǎn)生引物二聚體。 Tm值可參考下列公式計算： Tm=（ G+C） x 4 +（ A+T） x 2 向引物的 5’末端添加熒光素標(biāo)記、限制性酶切位點，噬菌體啟動子等。一般來說，這些序列的存在不會顯著地影響寡核苷酸和靶 DNA之間的復(fù)性。因為位于 DNA分子 5’末端的限制性酶切位點的切割效率比較低，所以，引物應(yīng)當(dāng)超出限制性內(nèi)切酶識別位點至少 3個核苷酸。這樣可以很容易地把來源于 cDNA的擴(kuò)增產(chǎn)物和來源于污染的基因組 DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)分開。 功能 ： 具 5 ′→3 ′DNA 聚合酶活性， 5 ’ →3 ′ 外切酶活性（在 QPCR中此活性有用），但不具有 3’ → 5’ 的外切酶活性（糾錯功能），導(dǎo)致其堿基誤摻入率偏高，不適用于突變檢測、測 序分析和基因表達(dá)中（可用 Pfu 高保真聚合酶代替），另外，它還具有非模板依賴性聚合酶活性，在 PCR合成終止后，在 3’端加一個 A,所以 PCR產(chǎn) 物并非我們通常所想象的是一個平末端。 特點： 高度耐熱，聚合反應(yīng)的最佳溫度為 75 ℃ ～ 80℃ 。在分子生物學(xué)中應(yīng)用廣泛。四種各 dNTP分子濃度必須相等，以減少錯配。 鎂離子 鎂離子濃度對 PCR反應(yīng)影響很大，既影響到 Taq DNA聚合酶的活性和真實性，又影響到引物退火、模板和 PCR產(chǎn)物的解鏈溫度、產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體生成等。商品化的試劑盒中，鎂離子濃度一 般為 ，不同反應(yīng)體系所要求的濃度會有差異。 鎂離子濃度與產(chǎn)物特異性和產(chǎn)率的關(guān)系 模板 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ PCR)的模板 DNA可以是單鏈分子，也可以是雙鏈分子；可以是線狀分子，也可以是環(huán)狀分子，不過線狀分子比環(huán)狀分子的擴(kuò)增效果稍好。 不同來源的 DNA所需模板量不同，可參考 《 分子克隆 》 。 （二）循環(huán)參數(shù) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ PCR）參數(shù)包括循環(huán)中三階段的溫度及持續(xù)時間控制，以及循環(huán)的次數(shù)，這在一定程度上影響著聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的成功與否 。 變性的時間和溫度 模板 DNA的變性不充分是導(dǎo)致 PCR失敗的一個重要原因。 引物退火的溫度與時間 引物的退火溫度和所需時間長短取決于反應(yīng)體系中擴(kuò)增的基因組成及引物的長度、濃度和堿 基組成。 Tm＝ 4 (G+C)＋ 2 (A+T) 一般當(dāng)引物中 G+C含量高、長度較長并與模板完全配對時，應(yīng)提高退火溫度。 當(dāng)然， 退火溫度也不能過高 ，否則引物不能與模板很好得結(jié)合，得不到擴(kuò)增產(chǎn)物。 退火與產(chǎn)物特異性的關(guān)系 延伸時間和溫度 延伸的時間長短取決于目的序列的長度、使用的 PCR儀等。對 2Kb以上長片段 DNA的擴(kuò)增可適當(dāng)延長時間 。 ④ Taq酶失活或有雜酶污染 重新?lián)Q一份 Taq酶 ⑤ Mg2+濃度過低 增加 Mg2+的濃度，必要時做一個濃度梯度 ⑥ 退火的溫度太高 用盡可能低的退火溫度，看有沒有目的產(chǎn)物，如有再逐步提高 T 問題 2：非特異產(chǎn)物擴(kuò)增 可能的原因 解決的方案 ① 模板 DNA中含有與引 物同源性高的其它位點 提高退火溫度或采用熱啟動 PCR、增效 PCR和 TDPCR技術(shù)（ Touch Down－ PCR） ,TDPCR技術(shù)可以作為實驗室常規(guī)技術(shù)使用，而不僅只在出現(xiàn)非特異性產(chǎn)物時才使用。當(dāng)使用 TDPCR技術(shù)時，這些問題也往往會一并解決。建議不要使用回收 Tip頭做反應(yīng)。注意酸、堿、酒精和高壓滅菌均不能徹底破壞吸附于這類器材上的 DNA。 ④ 操作區(qū)域存在污染 在有紫外燈的超凈工作臺操作，實驗完成后，應(yīng)馬上處理廢棄物并進(jìn)行紫外照射。 利用尿嘧啶 N糖苷酶（ UDG） 解決遺留污染的方法 原理： UDG可以切斷含有尿嘧啶核苷的 DNA雙鏈。在每次 PCR之前，均將設(shè)置好的PCR反應(yīng)體系用 UDG處理，那么其中的遺留污染 DNA(假如有的話 )將被破壞，不能作為下面 PCR反應(yīng)的底物，由于在后續(xù)的熱變性過程中 UDG將被滅活，所以事先加入的 UDG不會對本反應(yīng)的產(chǎn)物構(gòu)成任何影響。 即在引物合成過程中用 dUTP代替 dTTP，用這類引物引導(dǎo)合成的 PCR產(chǎn)物在兩條鏈的 5’端引物部位含有 dU，用 UDG 處理后，該區(qū)段被破壞，剩余的部分在后續(xù)的 PCR循環(huán)中不能作為有效模板被擴(kuò)增。 第四節(jié) 一個標(biāo)準(zhǔn) PCR實驗的設(shè)計 第一步 設(shè)計引物 引物設(shè)計是否合理，是決定 PCR反應(yīng)成敗的關(guān)鍵。所以，在這方面我們應(yīng)多花點時間，可以避免以后少走彎路。 2）用 Primer Oligo 進(jìn)行引物探針的設(shè)計。 根據(jù)我的實驗經(jīng)驗，最好參考國外的文獻(xiàn)，等級越高可靠性越高。 4）細(xì)讀試劑盒說明書、熟悉操作步驟、制定 具體可行的操作方案。對于這種情況，可設(shè)置二步 PCR，先用較低濃度的引物進(jìn)行初級 PCR，此時由于引物少，形成引物二聚體的可能減少，但它并不影響靶序列的擴(kuò)增，只是由于引物少產(chǎn)量不高。 熱啟動 PCR（ Hot start PCR） 熱啟動是一種在 PCR反應(yīng)中優(yōu)化目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物的方法， 同時也能抑制非特異產(chǎn)物的擴(kuò)增。 在 PCR反應(yīng)第一個循環(huán)之前的加溫步驟可去除并降低寡 核苷酸引物非特異性復(fù)性的可能性，而 DNA聚合酶活性的缺 失則阻止了錯配引物的延伸。 2） PE公司的蠟?zāi)じ綦x法：更適用于不帶熱蓋的 PCR儀。 3）單克隆抗體法：抗體與 Taq酶結(jié)合抑制其活性。此法適 用于各種 PCR儀。 應(yīng) 用 熱啟動 PCR對于已優(yōu)化的單個 PCR反應(yīng)沒有必要。 例如當(dāng)反應(yīng)中的模板 DNA少于 10 個拷貝數(shù) 時，或當(dāng)模板 DNA復(fù)雜度非常高時（如哺乳動物基因組 DNA），或當(dāng) PCR包括幾對寡核苷酸引物時， 即多重 PCR (multiplex PCR) ，在這些情況下，熱啟動 PCR和降落 PCR結(jié)合有著很好的應(yīng)用價值。 原 理 該方法是指在一次 PCR過程中把復(fù)性溫度設(shè)定在由高變低的一定范圍內(nèi)。當(dāng)達(dá)到引物特異引導(dǎo)的許可溫度時，目的序列開始擴(kuò)增。然而，這時特異性產(chǎn)物此時已占據(jù)絕對優(yōu)勢并且能有效地抑制非特異擴(kuò)增產(chǎn)物的積累。 94 ℃ 5min 68 ℃ 72 ℃ 94 ℃ 2 CYCLES 94 ℃ 67 ℃ 72 ℃ 94 ℃ 2 CYCLES 72 ℃ 94 ℃ 2 CYCLES 66 ℃ 94 ℃ … TouchDown PCR 中溫度變化規(guī)律 94 ℃ 72 ℃ 94 ℃ 2 CYCLES 58 ℃ 72 ℃ 94 ℃ 20 CYCLES 56 ℃ 94 ℃ 72 ℃ 10min 4℃ … TouchDown PCR 中溫度變化規(guī)律 巢式 PCR（ nest PCR） 此時也是進(jìn)行二步 PCR，與上面不同的是，第二級 PCR需另行設(shè)置反應(yīng)體系，并應(yīng)用另外的 PCR引物，此時引物的位置位于初級 PCR引物的內(nèi)側(cè)，用初級 PCR產(chǎn)物做模板，進(jìn)行第二步 PCR，這樣只有初級 PCR中特異的擴(kuò)增片段才能被二級引物擴(kuò)增。 在同一 PCR體系中加入數(shù)對 PCR引物，如 果這些引物的退火溫度相近，并且所覆蓋的 區(qū)域不重疊，這樣的反應(yīng)體系可同時擴(kuò)增多 個 DNA片段。 多重 PCR (Multiplex PCR) 利用多重 PCR對缺失突變型 DMD進(jìn)行基因診斷 實線代表缺失區(qū)，虛線代表可能缺失區(qū) RTPCR RTPCR是以 mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶作用合成 cDNA。應(yīng)用于基因表達(dá)與調(diào)控的研究。 3） 95 ℃ 變性，逆轉(zhuǎn)錄酶滅活、 RNAcDNA雜合物變性。為提高特異性可采用熱啟動或降落 PCR技術(shù) 5） 電泳檢測結(jié)果。多聚胸腺嘧啶核苷酸通用型引物 Oligo（ dT） 。多數(shù)情況下使用 Oligo（ dT），但對不含 Poly(A)尾的 mRNA（如組蛋白）不適用。這樣可以很容易地把來源于 cDNA的擴(kuò)增產(chǎn)物和來源于污染的基因組 DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)分開（片段大小不同）。 VNTRPCR技術(shù) 數(shù)目變異串聯(lián)重復(fù) （ variable number tendom repeats, VNTR）序列以各自的核心序列（通常為２～ 6bp的重復(fù)單元，如 (CGG)n等，稱為微衛(wèi)星 DNA）首尾相連多次重復(fù)，由于其重復(fù)數(shù)在人群中呈高度變異，故稱為 數(shù)目變異串聯(lián)重復(fù)序列 。 這種多態(tài)性可以通過在 VNTR重復(fù)序列的兩側(cè)保守區(qū)域設(shè)計一對引物對變異區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。據(jù)此，可檢測出 DNA中單個堿基的替代、微缺失或插入。在疑有突變的 DNA片段附近設(shè)計一對引物，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物經(jīng)甲酰胺等變性，并在聚丙烯酰胺凝膠中電泳（中性膠），突變所引起的DNA構(gòu)象差異將表現(xiàn)為電泳條帶位置的差異，從而作出判斷。但受溫度的影響大，所以，最好用帶恒溫裝置的電泳儀跑膠，往往可得到較理想的結(jié)果。在現(xiàn)代分子生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。 PCRELISA技術(shù) PCR ELISA是將 PCR與核酸雜交、 ELISA 連為一體， 用 ELISA鑒定 PCR產(chǎn)物的一種方法， 它避免了因使用 Southern Blotting所帶來的放射性污染。 ) 七、醫(yī)學(xué)應(yīng)用 （遺傳病診斷、惡性腫瘤診斷及預(yù)后、各種病原 體的檢測、移植配型等） 八、獲取生物學(xué)證據(jù) （親子鑒定、個體識別等） 九、性別控制 （ SRY基因的 PCR檢測，用于兩性畸形診斷及性 連鎖疾病的性別控制） 十、轉(zhuǎn)基因檢測 （應(yīng)用 QPCR檢測轉(zhuǎn)基因生物的 GMO基因） 第七節(jié) 實時熒光定量 PCR技術(shù)的 原理及應(yīng)用 (Real time Quantitative PCR) 通過前面的學(xué)習(xí)，我們已經(jīng)知道 PCR可對特定核苷酸片斷進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增。無論定性還是半定量分析，分析的都是 PCR終產(chǎn)物。而起始模板量與 PCR終產(chǎn)物的