pcr技術的原理、操作及應用(已修改)
2025-01-31 08:14 本頁面
【正文】 PCR技術的原理、操作及應用 湖南省疾病預防控制中心微生物檢驗科 黃一偉 什么是 PCR ? PCR: Polymerase chain reaction，即聚合酶鏈反應 ? 是 80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術 PCR技術的發(fā)展歷史 1985 關于 PCR 的文章首次由美國科學家 Kary Mullis等人在 《 Science》 雜志上發(fā)表 1989 《 Science》 雜志報道了耐熱性 DNA多聚酶 Taq酶（生活在溫泉中的水生嗜熱桿菌內提取到的一種耐熱的 DNA聚合酶 ）的發(fā)現 ,預示著分子時代的到來。12月 《 Science》 雜志將 PCR和它所使用的聚合酶命名為第一個“年度分子”。 1993 Kary Mullis 因 PCR的發(fā)明獲得諾貝爾化學獎。 PCR技術的原理 1 遺傳物質： 細胞核 ? 染色體 ? DNA（脫氧核糖核酸和磷酸鏈和堿基構成 ) 堿基（ A、 T、 C、 G）是按雙鏈螺旋排列的，堿基序列的長度和排列的順序決定了生物的多樣性。 比如人類體細胞中共有 31億個堿基對，按上述的 %的差，人和人之間有 3百萬個堿基對的差別。 PCR的基本工作原理就是以擬擴增的DNA分子為模板，以一對分別與模板互補的寡核苷酸片段為引物，在 DNA聚合酶的作用下，按照半保留復制的機理沿著模板鏈延伸直至完成新的 DNA合成。 PCR技術的原理 2 ? PCR反應的基本成分 ? 包括 7種基本成分：模板DNA、特異性引物、熱穩(wěn)定 DNA聚合酶、脫氧核苷三磷酸（ dNTP）、二價陽離子、緩沖液及一價陽離子 ? 基本反應步驟 ：變性 退火 延伸 ? 最后通過染料如 EB染色DNA后在紫外燈下顯色檢出 PCR技術的原理 3 1 2 3 4 5 22 55 72 94 時間（ min） 溫度 （ ℃ ） 適溫延伸 3 高溫變性 1 低溫退火 2 重復 1~3步 25~35輪 目的 DNA片段 擴增 100萬倍以上 DNA雙螺旋 DNA單鏈 與引物復性 DNA變性 形成2條單鏈 子鏈延伸 DNA加倍 RTPCR的原理 ? 相對于 PCR，在開始階段增加步驟： RNA ? cDNA合成，是單鏈到雙鏈的過程。 實時熒光定量 PCR的原理 1 ? 實時熒光定量 PCR技術 (RealTime Quantitative PCR) 是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累 實時監(jiān)測整個 PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。 常用的熒光定量 PCR試劑： SYBR Green I Taqman水解探針 實時熒光定量 PCR的原理 2 ? 基線（ Baseline）
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