轉(zhuǎn)染技術(shù)原理及應(yīng)用(已修改)
2025-07-26 22:42 本頁面
【正文】 細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)原理及應(yīng)用常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)分為兩大類，一類是瞬時轉(zhuǎn)染，一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（永久轉(zhuǎn)染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個宿主細(xì)胞中可存在多個拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動子和其它調(diào)控元件的分析。一般來說，超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高，在轉(zhuǎn)染后2472小時內(nèi)（依賴于各種不同的構(gòu)建）分析結(jié)果，常常用到一些報告系統(tǒng)如熒光蛋白，β半乳糖苷酶等來幫助檢測。后者也稱穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。盡管線性DNA比超螺旋DNA轉(zhuǎn)入量低但整合率高。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/104轉(zhuǎn)染細(xì)胞能整合，通常需要通過一些選擇性標(biāo)記，如來氨丙基轉(zhuǎn)移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染技術(shù)的選擇對轉(zhuǎn)染結(jié)果影響也很大，許多轉(zhuǎn)染方法需要優(yōu)化DNA與轉(zhuǎn)染試劑比例，細(xì)胞數(shù)量，培養(yǎng)及檢測時間等。一些傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染技術(shù)，如DEAE右旋糖苷法，磷酸鈣法，電穿孔法，脂質(zhì)體法各有利弊，其主要原理及應(yīng)用特點見下表：轉(zhuǎn)染方法原理應(yīng)用特點磷酸鈣法磷酸鈣DNA復(fù)合物吸附細(xì)胞膜被細(xì)胞內(nèi)吞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染瞬時性轉(zhuǎn)染不適用于原代細(xì)胞操作簡便但重復(fù)性差有些細(xì)胞不適用DEAE右旋糖苷法帶正電的DEAE右旋糖苷與核酸帶負(fù)電的磷酸骨架相互作用形成的復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞瞬時性轉(zhuǎn)染相對簡便、結(jié)果可重復(fù)但對細(xì)胞有一定的毒副作用轉(zhuǎn)染時需除血清電穿孔法高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜電位，DNA通過膜上形成的小孔導(dǎo)入穩(wěn)定轉(zhuǎn)染瞬時性轉(zhuǎn)染所有細(xì)胞適用性廣但細(xì)胞致死率高，DNA和細(xì)胞用量大， 需根據(jù)不同細(xì)胞類型優(yōu)化電穿孔實驗條件病毒介導(dǎo)法通過侵染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、原代細(xì)胞，體內(nèi)細(xì)胞等逆轉(zhuǎn)錄病毒特定宿主細(xì)胞但攜帶基因不能太大細(xì)胞需處分裂期需考慮安全因素腺病毒通過侵染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中瞬時轉(zhuǎn)染特定宿主細(xì)胞可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞需考慮安全因素陽離子脂質(zhì)體法帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染瞬時性轉(zhuǎn)染所有細(xì)胞適用性廣，轉(zhuǎn)染效率高，重復(fù)性好，但轉(zhuǎn)染時需除血清。轉(zhuǎn)染效果隨細(xì)胞類型變化大Biolistic顆粒傳遞法將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀，再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細(xì)胞，DNA在胞內(nèi)逐步釋放，表達(dá)瞬時性轉(zhuǎn)染可用于：人的表皮細(xì)胞，纖維原細(xì)胞，淋巴細(xì)胞系以及原代細(xì)胞顯微注射法用顯微操作將DNA直接注入靶細(xì)胞核穩(wěn)定轉(zhuǎn)染瞬時性轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)有限,多用于工程改造或轉(zhuǎn)基因動物的胚胎細(xì)胞（各種轉(zhuǎn)染方法的比較）除上述傳統(tǒng)方法外，近年來國際上推出了一些陽離子聚合物基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，以其適用宿主范圍廣，操作簡便，對細(xì)胞毒性小，轉(zhuǎn)染效率高受到研究者們的青睞。其中樹枝狀聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亞胺（Polyethylenimine，PEI）的轉(zhuǎn)染性能最佳，但樹枝狀聚合物的結(jié)構(gòu)不易于進(jìn)一步改性，且其合成工藝復(fù)雜。聚乙烯亞胺是一種具有較高的陽離子電荷密度的有機(jī)大分子，每相隔二個碳個原子，即每“第三個原子都是質(zhì)子化的氨基氮原子，使得聚合物網(wǎng)絡(luò)在任何pH下都能充當(dāng)有效的“質(zhì)子海綿”(proton
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