轉(zhuǎn)染技術(shù)原理及應(yīng)用(存儲版)
【正文】 istic 顆粒傳遞法將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀，再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細胞，DNA在胞內(nèi)逐步釋放，表達瞬時性轉(zhuǎn)染 可用于：人的表皮細胞，纖維原細胞，淋巴細胞系以及原代細胞 顯微注射法用顯微操作將DNA直接注入靶細胞核 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，瞬時性轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染細胞數(shù)有限，多用于工程改造或轉(zhuǎn)基因動物的胚胎細胞第 7 頁 共 7 頁。如果基因產(chǎn)物對細胞有毒性作用，轉(zhuǎn)染也很難進行，因此選擇組成或可調(diào)控，強度合適的啟動子也很重要，同時做空載體及其它基因的相同載體構(gòu)建的轉(zhuǎn)染正對照可排除毒性影響的干擾。通常的，血清是一種包含生長因子及其它輔助因子的不確切成分的添加物，對不同細胞的生長作用有很大的差別。轉(zhuǎn)染效率收多種因素影響，主要因素有下面幾個：1. 細胞培養(yǎng)物健康的細胞培養(yǎng)物是成功轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)。隨著功能研究的興起，其應(yīng)用越來越廣泛。此外，對一些內(nèi)毒素敏感的細胞（如原代細胞，懸浮細胞和造血細胞），QIAGEN還提供可去除內(nèi)毒素污染的質(zhì)粒抽提試劑盒，在質(zhì)粒抽提過程中有效去除脂多糖分子，保證理想的轉(zhuǎn)染效果。比如青霉素和鏈霉素，就是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。（3）血清血清一度曾被認為會降低轉(zhuǎn)染效率，老一代的轉(zhuǎn)染方法往往要求轉(zhuǎn)染前后洗細胞或者在無血清培養(yǎng)基條件下轉(zhuǎn)染，但有些對此敏感的細胞如原代細胞會受到損傷，甚至死亡導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率極低。一定要避免細菌，支原體或真菌的污染。也就是說同一種系的細胞株，在各實驗室不同培養(yǎng)條件下，其生物學(xué)性狀發(fā)生不同程度的改變，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)染特性也發(fā)生變化。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/104轉(zhuǎn)染細胞能整合，通常需要通過一些選擇性標(biāo)記，如來氨丙基轉(zhuǎn)移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細胞系。隨著分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)染已經(jīng)成為研究和控制真核細胞基因功能的常規(guī)工具。線型PEI（Line PEI,LPEI）與其衍生物用作基因轉(zhuǎn)染載體的研究比分枝狀PEI（Branched PEI,BPEI）要早一些，過去的研究認為在不考慮具體條件，LPEI/DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物的細胞毒性較低，有利于細胞定位，因此與BPEI相比應(yīng)該轉(zhuǎn)染效率高一些。轉(zhuǎn)染效果隨細胞類型變化大Biolistic顆粒傳遞法將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀，再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細胞，DNA在胞內(nèi)逐步釋放，表達瞬時性轉(zhuǎn)染可用于：人的表皮細胞，纖維原細胞，淋巴細胞系以及原代細胞顯微注射法用顯微操作將DNA直接注入靶細胞核穩(wěn)定轉(zhuǎn)染瞬時性轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染細胞數(shù)有限,多用于工程改造或轉(zhuǎn)基因動物的胚胎細胞（各種轉(zhuǎn)染方法的比較）細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)原理及應(yīng)用常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)分為兩大類，一類是瞬時轉(zhuǎn)染，一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（永久轉(zhuǎn)染）。一些傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染技術(shù)，如DEAE右旋糖苷法，磷酸鈣法，電穿孔法，脂質(zhì)體法各有利弊，其主要原理及應(yīng)用特點見下表：轉(zhuǎn)染方法原理應(yīng)用特點磷酸鈣法磷酸鈣DNA復(fù)合物吸附細胞膜被細胞內(nèi)吞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染瞬時性轉(zhuǎn)染不適用于原代細胞操作簡便但重復(fù)性差有些細胞不適用DEAE右旋糖苷法帶正電的DEAE右旋糖苷與核酸帶負電的磷酸骨架相互作用形成的復(fù)合物被細胞內(nèi)吞瞬時性轉(zhuǎn)染相對簡便、結(jié)果可重復(fù)但對細胞有一定的毒副作用轉(zhuǎn)染時需除血清電穿孔法高脈沖電壓破壞細胞膜電位，DNA通過膜上形成的小孔導(dǎo)入
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