轉染技術原理及應用(存儲版)
【正文】 istic 顆粒傳遞法將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀，再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細胞，DNA在胞內逐步釋放，表達瞬時性轉染 可用于：人的表皮細胞，纖維原細胞，淋巴細胞系以及原代細胞 顯微注射法用顯微操作將DNA直接注入靶細胞核 穩(wěn)定轉染，瞬時性轉染 轉染細胞數(shù)有限，多用于工程改造或轉基因動物的胚胎細胞第 7 頁 共 7 頁。如果基因產物對細胞有毒性作用，轉染也很難進行，因此選擇組成或可調控，強度合適的啟動子也很重要，同時做空載體及其它基因的相同載體構建的轉染正對照可排除毒性影響的干擾。通常的，血清是一種包含生長因子及其它輔助因子的不確切成分的添加物，對不同細胞的生長作用有很大的差別。轉染效率收多種因素影響，主要因素有下面幾個：1. 細胞培養(yǎng)物健康的細胞培養(yǎng)物是成功轉染的基礎。隨著功能研究的興起，其應用越來越廣泛。此外，對一些內毒素敏感的細胞（如原代細胞，懸浮細胞和造血細胞），QIAGEN還提供可去除內毒素污染的質粒抽提試劑盒，在質粒抽提過程中有效去除脂多糖分子，保證理想的轉染效果。比如青霉素和鏈霉素，就是影響轉染的培養(yǎng)基添加物。（3）血清血清一度曾被認為會降低轉染效率，老一代的轉染方法往往要求轉染前后洗細胞或者在無血清培養(yǎng)基條件下轉染，但有些對此敏感的細胞如原代細胞會受到損傷，甚至死亡導致轉染效率極低。一定要避免細菌，支原體或真菌的污染。也就是說同一種系的細胞株，在各實驗室不同培養(yǎng)條件下，其生物學性狀發(fā)生不同程度的改變，導致其轉染特性也發(fā)生變化。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/104轉染細胞能整合，通常需要通過一些選擇性標記，如來氨丙基轉移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸轉移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反復篩選，得到穩(wěn)定轉染的同源細胞系。隨著分子生物學和細胞生物學研究的不斷發(fā)展，轉染已經成為研究和控制真核細胞基因功能的常規(guī)工具。線型PEI（Line PEI,LPEI）與其衍生物用作基因轉染載體的研究比分枝狀PEI（Branched PEI,BPEI）要早一些，過去的研究認為在不考慮具體條件，LPEI/DNA轉染復合物的細胞毒性較低，有利于細胞定位，因此與BPEI相比應該轉染效率高一些。轉染效果隨細胞類型變化大Biolistic顆粒傳遞法將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀，再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細胞，DNA在胞內逐步釋放，表達瞬時性轉染可用于：人的表皮細胞，纖維原細胞，淋巴細胞系以及原代細胞顯微注射法用顯微操作將DNA直接注入靶細胞核穩(wěn)定轉染瞬時性轉染轉染細胞數(shù)有限,多用于工程改造或轉基因動物的胚胎細胞（各種轉染方法的比較）細胞轉染技術原理及應用常規(guī)轉染技術分為兩大類，一類是瞬時轉染，一類是穩(wěn)定轉染（永久轉染）。一些傳統(tǒng)的轉染技術，如DEAE右旋糖苷法，磷酸鈣法，電穿孔法，脂質體法各有利弊，其主要原理及應用特點見下表：轉染方法原理應用特點磷酸鈣法磷酸鈣DNA復合物吸附細胞膜被細胞內吞穩(wěn)定轉染瞬時性轉染不適用于原代細胞操作簡便但重復性差有些細胞不適用DEAE右旋糖苷法帶正電的DEAE右旋糖苷與核酸帶負電的磷酸骨架相互作用形成的復合物被細胞內吞瞬時性轉染相對簡便、結果可重復但對細胞有一定的毒副作用轉染時需除血清電穿孔法高脈沖電壓破壞細胞膜電位，DNA通過膜上形成的小孔導入
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