轉(zhuǎn)染技術(shù)原理及應(yīng)用-wenkub
2022-08-11 22:42:07 本頁面
【正文】 解的PEI衍生物。目前在設(shè)計更復(fù)雜的基因載體時，PEI經(jīng)常做為核心組成成分。其中樹枝狀聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亞胺（Polyethylenimine，PEI）的轉(zhuǎn)染性能最佳，但樹枝狀聚合物的結(jié)構(gòu)不易于進(jìn)一步改性，且其合成工藝復(fù)雜。一些傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染技術(shù)，如DEAE右旋糖苷法，磷酸鈣法，電穿孔法，脂質(zhì)體法各有利弊，其主要原理及應(yīng)用特點見下表：轉(zhuǎn)染方法原理應(yīng)用特點磷酸鈣法磷酸鈣DNA復(fù)合物吸附細(xì)胞膜被細(xì)胞內(nèi)吞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染瞬時性轉(zhuǎn)染不適用于原代細(xì)胞操作簡便但重復(fù)性差有些細(xì)胞不適用DEAE右旋糖苷法帶正電的DEAE右旋糖苷與核酸帶負(fù)電的磷酸骨架相互作用形成的復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞瞬時性轉(zhuǎn)染相對簡便、結(jié)果可重復(fù)但對細(xì)胞有一定的毒副作用轉(zhuǎn)染時需除血清電穿孔法高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜電位，DNA通過膜上形成的小孔導(dǎo)入穩(wěn)定轉(zhuǎn)染瞬時性轉(zhuǎn)染所有細(xì)胞適用性廣但細(xì)胞致死率高，DNA和細(xì)胞用量大， 需根據(jù)不同細(xì)胞類型優(yōu)化電穿孔實驗條件病毒介導(dǎo)法通過侵染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、原代細(xì)胞，體內(nèi)細(xì)胞等逆轉(zhuǎn)錄病毒特定宿主細(xì)胞但攜帶基因不能太大細(xì)胞需處分裂期需考慮安全因素腺病毒通過侵染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中瞬時轉(zhuǎn)染特定宿主細(xì)胞可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞需考慮安全因素陽離子脂質(zhì)體法帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染瞬時性轉(zhuǎn)染所有細(xì)胞適用性廣，轉(zhuǎn)染效率高，重復(fù)性好，但轉(zhuǎn)染時需除血清。后者也稱穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)原理及應(yīng)用常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)分為兩大類，一類是瞬時轉(zhuǎn)染，一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（永久轉(zhuǎn)染）。盡管線性DNA比超螺旋DNA轉(zhuǎn)入量低但整合率高。轉(zhuǎn)染效果隨細(xì)胞類型變化大Biolistic顆粒傳遞法將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀，再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細(xì)胞，DNA在胞內(nèi)逐步釋放，表達(dá)瞬時性轉(zhuǎn)染可用于：人的表皮細(xì)胞，纖維原細(xì)胞，淋巴細(xì)胞系以及原代細(xì)胞顯微注射法用顯微操作將DNA直接注入靶細(xì)胞核穩(wěn)定轉(zhuǎn)染瞬時性轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)有限,多用于工程改造或轉(zhuǎn)基因動物的胚胎細(xì)胞（各種轉(zhuǎn)染方法的比較）聚乙烯亞胺是一種具有較高的陽離子電荷密度的有機大分子，每相隔二個碳個原子，即每“第三個原子都是質(zhì)子化的氨基氮原子，使得聚合物網(wǎng)絡(luò)在任何pH下都能充當(dāng)有效的“質(zhì)子海綿”(proton sponge)體。線型PEI（Line PEI,LPEI）與其衍生物用作基因轉(zhuǎn)染載體的研究比分枝狀PEI（Branched PEI,BPEI）要早一些，過去的研究認(rèn)為在不考慮具體條件，LPEI/DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物的細(xì)胞毒性較低，有利于細(xì)胞定位，因此與BPEI相比應(yīng)該轉(zhuǎn)染效率高一些。聚合物的分枝結(jié)構(gòu)使得其具有較高的正電性，因此易于高效地包裹各種DNA、RNA分子及質(zhì)粒形成小的納米顆粒，從而提高轉(zhuǎn)染效率，當(dāng)所形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞以后，其中所含的生理條件下可降解的化學(xué)鍵在細(xì)胞內(nèi)水解，使交聯(lián)聚合物分解為無細(xì)胞毒性的小分子PEI，這樣結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)染試劑在體外應(yīng)用可以獲得高的轉(zhuǎn)染效率和低的細(xì)胞毒性，其可降解性對體內(nèi)應(yīng)用也具有重要的意義。隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)染已經(jīng)成為研究和控制真核細(xì)胞基因功能的
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