轉染技術原理及應用(更新版)
【正文】 的轉染技術，如DEAE右旋糖苷法，磷酸鈣法，電穿孔法，脂質體法各有利弊，其主要原理及應用特點見下：轉染方法 原理 應用 特點 DEAE右旋糖苷法帶正電的DEAE右旋糖苷與核酸帶負電的磷酸骨架相互作用形成的復合物被細胞內吞 瞬時性轉染 相對簡便、結果可重復但對細胞有一定的毒副作用，轉染時需除血清磷酸鈣法磷酸鈣DNA復合物吸附細胞膜被細胞內吞 穩(wěn)定轉染，瞬時性轉染 不適用于原代細胞，操作簡便但重復性差，有些細胞不適用。病毒載體對特定宿主細胞感染效率較高，但不同病毒載體有其特定的宿主，有的還要求特定的細胞周期，如逆轉錄病毒需侵染分裂期的宿主細胞，此外還需考慮一些安全問題（如基因污染）。2. 血清大多數(shù)培養(yǎng)基在使用前需要加血清。盡管線性DNA比超螺旋DNA轉入量低但整合率高。如果基因產(chǎn)物對細胞有毒性作用，轉染也很難進行，因此選擇組成或可調控，強度合適的啟動子也很重要，同時做空載體及其它基因的相同載體構建的轉染正對照可排除毒性影響的干擾。一般的轉染技術（如脂質體等）基于電荷吸引原理，如果DNA不純，如帶少量的鹽離子，蛋白，代謝物污染都會顯著影響轉染復合物的有效形成及轉染的進行，但對GenEscort系列轉染試劑影響不大。新加培養(yǎng)基的預熱對細胞轉染很有幫助。不同的實驗目的也會影響轉染時的鋪板密度，比如研究細胞周期相關基因等表達周期長的基因，就需要較低的鋪板密度，所以需要選擇能夠在較低鋪板密度下進行轉染的試劑。高的轉染效率需要一定的細胞密度，一般的轉染試劑都會有專門的說明。細胞培養(yǎng)在實驗室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變，總染色體重組或基因調控變化等而演化。后者也稱穩(wěn)定轉染，外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。大量實驗證明，PEI是非常有希望的基因治療載體。轉染技術的選擇對轉染結果影響也很大，許多轉染方法需要優(yōu)化DNA與轉染試劑比例，細胞數(shù)量，培養(yǎng)及檢測時間等。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個宿主細胞中可存在多個拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動子和其它調控元件的分析。但最近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的轉染復合物，從而提高轉染效率，但同時細胞毒性也增大。在研究基因功能、調控基因表達、突變分析和蛋白質生產(chǎn)等生物學試驗中，其應用越來越廣泛。轉染效率受多種因素影響，主要因素有下面幾個：1．轉染試劑不同細胞系轉染效率通常不同，但細胞系的選擇通常是根據(jù)實驗的需要，因此在轉染實驗前應根據(jù)實驗要求和細胞特性選擇適合的轉染試劑。因此，如果發(fā)現(xiàn)轉染效率降低，可以試著轉染新鮮培養(yǎng)的細胞以恢復最佳結果。（2）細胞密度細胞密度對轉染效率有一定的影響。不過轉染產(chǎn)品配方幾經(jīng)革新后的今天，對于主流的轉染試劑來說，血清的存在已經(jīng)不會影響轉染效率，甚至還有助于提高轉染效率，如陽離子聚合物等，血清的存在會影響DNA—轉染復合物的形成，但只要在DNA轉染復合物形成時用無血清培養(yǎng)基或PBS來稀釋DNA和轉染試劑就可以了，在轉染過程中是可以使用血清的。這些抗生素一般對于真核細胞無毒，但有些轉染試劑增加了細胞的通透性，使抗生素可以進入細胞。但如果使用GenEscort轉染試劑，一般不需要這么高的DNA質量要求。以下就向大家介紹一些轉染的技術要點及市面上主要的轉染試劑類型的選擇。不同細胞有不同的培養(yǎng)基，血清和添加物。血清質量的變化直接影響轉染效率。4. DNA質量DNA質量對轉染效率影
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