轉(zhuǎn)染技術(shù)原理及應(yīng)用-wenkub.com
2025-07-11 22:42 本頁面
【正文】 電穿孔法高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜電位，DNA通過膜上形成的小孔導(dǎo)入 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染，所有細(xì)胞 適用性廣但細(xì)胞致死率高，DNA和細(xì)胞用量大，需根據(jù)不同細(xì)胞類型優(yōu)化電穿孔實(shí)驗(yàn)條件 陽離子性的脂質(zhì)體法帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染，所有細(xì)胞 適用性廣，轉(zhuǎn)染效率高，重復(fù)性好但轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清轉(zhuǎn)染效果隨細(xì)胞類型變化大 病毒介導(dǎo)法逆轉(zhuǎn)錄病毒 通過侵染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，特定宿主細(xì)胞 可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、原代細(xì)胞，體內(nèi)細(xì)胞等，但攜帶基因不能太大細(xì)胞需處分裂期，需考慮安全因素 ，腺病毒 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，特定宿主細(xì)胞 可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，需考慮安全因素。核酸純化世界第一品牌德國QIAGEN公司提供的超純質(zhì)粒抽提試劑盒，能達(dá)到兩倍2x CsCl梯度離心以上的純度效果，使您不必為DNA質(zhì)量操心。除載體構(gòu)建外，載體的形態(tài)及大小對(duì)轉(zhuǎn)染效率也有不同的影響，如前面提到的超螺旋及線性DNA對(duì)瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的影響。有些轉(zhuǎn)染技術(shù)如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染在有血清存在情況下效率很低，因此在轉(zhuǎn)染前要除血清。胎牛血清（FCS）經(jīng)常用到，便宜一點(diǎn)的有馬或牛血清。高的轉(zhuǎn)染效率需要一定的細(xì)胞密度，一般的轉(zhuǎn)染試劑都會(huì)有專門的說明。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/104轉(zhuǎn)染細(xì)胞能整合，通常需要通過一些選擇性標(biāo)記，如來氨丙基轉(zhuǎn)移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個(gè)宿主細(xì)胞中可存在多個(gè)拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動(dòng)子和其它調(diào)控元件的分析。轉(zhuǎn)染技術(shù)的要點(diǎn)及轉(zhuǎn)染試劑正確選擇轉(zhuǎn)染技術(shù)的要點(diǎn)及轉(zhuǎn)染試劑正確選擇轉(zhuǎn)染技術(shù)是指將外源分子如DNA，RNA等導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)，它是研究基因表達(dá)調(diào)控，突變分析等的常規(guī)工具。4．載體構(gòu)建轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建（病毒載體，質(zhì)粒DNA，RNA，PCR產(chǎn)物，寡核苷酸等）也影響轉(zhuǎn)染結(jié)果。核酸純化世界第一品牌德國QIAGEN公司提供的超純質(zhì)粒抽提試劑盒，能達(dá)到兩倍2CsCl梯度離心以上的純度效果，使您不必為DNA質(zhì)量操心。目前轉(zhuǎn)染試劑因?yàn)槿潭伎梢杂糜醒搴涂股氐忍砑觿┑耐耆囵B(yǎng)基來操作，非常方便，省去了污染等麻煩。（4）抗生素細(xì)胞培養(yǎng)過程中往往會(huì)添加抗生素來防止污染，但是這些添加劑可能對(duì)轉(zhuǎn)染造成麻煩。胎牛血清（FCS）經(jīng)常用到，便宜一點(diǎn)的有馬或牛血清。一般轉(zhuǎn)染時(shí)貼壁細(xì)胞密度為50%90%，但這個(gè)需要參考所選轉(zhuǎn)染試劑的說明書。轉(zhuǎn)染時(shí)過高或者過低的細(xì)胞密度會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低，乃至表達(dá)水平偏低。推薦在轉(zhuǎn)染前24小時(shí)分細(xì)胞，這將提供正常細(xì)胞代謝，增加對(duì)外源DNA攝入的可能。轉(zhuǎn)染時(shí)應(yīng)跟據(jù)具體轉(zhuǎn)染試劑推薦的方法，但也要注意，因不同實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的細(xì)胞性質(zhì)不同，質(zhì)粒定量差異，操作手法上的差異等，其轉(zhuǎn)染效果可能不同，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的具體條件來確定最佳轉(zhuǎn)染條件。這會(huì)導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化。當(dāng)然，最適合的是高效、低毒、方便、廉價(jià)的轉(zhuǎn)染試劑。盡管線性DNA比超螺旋DNA轉(zhuǎn)入量低但整合率高。常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為兩大類，一類是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（永久轉(zhuǎn)染）。 轉(zhuǎn)染技術(shù)是指將外源分子如DNA，RNA等導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)。GenEscort是采用各種分枝狀和超高分枝狀的小分子PEI與各種含有生理?xiàng)l件下可降解鍵的交聯(lián)劑交聯(lián)，合成出的一系列高分枝的可降
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