轉(zhuǎn)染技術(shù)原理及應(yīng)用-預(yù)覽頁
【正文】 與轉(zhuǎn)染試劑比例，細(xì)胞數(shù)量，培養(yǎng)及檢測時間等。一般來說，超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高，在轉(zhuǎn)染后2472小時內(nèi)（依賴于各種不同的構(gòu)建）分析結(jié)果，常常用到一些報告系統(tǒng)如熒光蛋白，β半乳糖苷酶等來幫助檢測。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個宿主細(xì)胞中可存在多個拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動子和其它調(diào)控元件的分析。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/104轉(zhuǎn)染細(xì)胞能整合，通常需要通過一些選擇性標(biāo)記，如來氨丙基轉(zhuǎn)移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。這種聚陽離子能將各種報告基因轉(zhuǎn)入各種種屬細(xì)胞，其效果好于脂質(zhì)聚酰胺，經(jīng)進(jìn)一步的改性后，其轉(zhuǎn)染性能好于樹枝狀聚合物，而且它的細(xì)胞毒性低。但最近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，從而提高轉(zhuǎn)染效率，但同時細(xì)胞毒性也增大。影響轉(zhuǎn)染實驗的因素在研究基因功能、調(diào)控基因表達(dá)、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等生物學(xué)試驗中，其應(yīng)用越來越廣泛。一般來說，超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高，在轉(zhuǎn)染后2472小時內(nèi)（依賴于各種不同的構(gòu)建）分析結(jié)果，常常用到一些報告系統(tǒng)如熒光蛋白，β 半乳糖苷酶等來幫助檢測。轉(zhuǎn)染效率受多種因素影響，主要因素有下面幾個：1．轉(zhuǎn)染試劑不同細(xì)胞系轉(zhuǎn)染效率通常不同，但細(xì)胞系的選擇通常是根據(jù)實驗的需要，因此在轉(zhuǎn)染實驗前應(yīng)根據(jù)實驗要求和細(xì)胞特性選擇適合的轉(zhuǎn)染試劑。最適合轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是經(jīng)過幾次傳代后達(dá)到指數(shù)生長期的細(xì)胞，細(xì)胞生長旺盛，最容易轉(zhuǎn)染。因此，如果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率降低，可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞以恢復(fù)最佳結(jié)果。不同細(xì)胞有不同的培養(yǎng)基，血清和添加物。（2）細(xì)胞密度細(xì)胞密度對轉(zhuǎn)染效率有一定的影響。陽離子脂質(zhì)體具有微量的細(xì)胞毒性而往往需要更高的鋪板密度或者更多的懸浮細(xì)胞數(shù)，有的要求細(xì)胞90%匯片；而有些多胺或者非脂質(zhì)體的配方則要求在40%80%之間，總之是盡量在細(xì)胞最適的生理狀態(tài)下轉(zhuǎn)染，以求最佳的轉(zhuǎn)染效果。不過轉(zhuǎn)染產(chǎn)品配方幾經(jīng)革新后的今天，對于主流的轉(zhuǎn)染試劑來說，血清的存在已經(jīng)不會影響轉(zhuǎn)染效率，甚至還有助于提高轉(zhuǎn)染效率，如陽離子聚合物等，血清的存在會影響DNA—轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成，但只要在DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物形成時用無血清培養(yǎng)基或PBS來稀釋DNA和轉(zhuǎn)染試劑就可以了，在轉(zhuǎn)染過程中是可以使用血清的。血清質(zhì)量的變化直接影響細(xì)胞生長，因此也會影響轉(zhuǎn)染效率。這些抗生素一般對于真核細(xì)胞無毒，但有些轉(zhuǎn)染試劑增加了細(xì)胞的通透性，使抗生素可以進(jìn)入細(xì)胞。（6）DNA質(zhì)量DNA質(zhì)量對轉(zhuǎn)染效率影響非常大。但如果使用GenEscort轉(zhuǎn)染試劑，一般不需要這么高的DNA質(zhì)量要求。除載體構(gòu)建外，載體的形態(tài)及大小對轉(zhuǎn)染效率也有不同的影響，如前面提到的超螺旋及線性DNA對瞬時和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的影響。以下就向大家介紹一些轉(zhuǎn)染的技術(shù)要點及市面上主要的轉(zhuǎn)染試劑類型的選擇。后者也稱穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。不同細(xì)胞有不同的培養(yǎng)基，血清和添加物。一定要避免細(xì)菌，支原體或真菌的污染。血清質(zhì)量的變化直接影響轉(zhuǎn)染效率。3. 載體構(gòu)建轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建（病毒載體，質(zhì)粒DNA，RNA，PCR產(chǎn)物，寡核苷酸等）也影響轉(zhuǎn)染結(jié)果。4. DNA質(zhì)量DNA質(zhì)量對轉(zhuǎn)染效率影響非常大。轉(zhuǎn)染技術(shù)的選擇對轉(zhuǎn)染結(jié)果影響也很大，許多轉(zhuǎn)染方法需要優(yōu)化DNA與轉(zhuǎn)染試劑比例，細(xì)胞數(shù)量，培養(yǎng)及檢
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