17-病理學(xué)常用技術(shù)的原理及應(yīng)用-wenkub.com
2025-08-01 07:45 本頁面
【正文】 后基因組時代的生物信息學(xué)技術(shù)籽為基因組功能預(yù)測、透視基因相互作用及其機制、利用生物分子的信息參與創(chuàng)新藥物的設(shè)計、生物學(xué)虛擬實驗?zāi)Ｐ偷臉?gòu)建等提供強大的技術(shù)支撐。通過數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)之間的關(guān)系，認識數(shù)據(jù)的本質(zhì)，并在此基礎(chǔ)上．了解基因與疾病的關(guān)系，了解疾病產(chǎn)生的機制，為疾病的診斷和治療提供依據(jù)。 生物信息學(xué)的研究范疇是以基因組DNA序列的信息分析作為源頭，分析基因組結(jié)陶，尋找或發(fā)現(xiàn)新基因，分析基因調(diào)控信息，并在此基礎(chǔ)上研究基因的功能，模擬和預(yù)測蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，分析蛋白質(zhì)的性質(zhì)以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之問的關(guān)系，為基于靶分子結(jié)構(gòu)的藥物分子設(shè)計和蛋白質(zhì)分子改性設(shè)計提供依據(jù)。生物信息學(xué)以計算機、網(wǎng)絡(luò)為工具，以數(shù)據(jù)庫為載體，利用數(shù)學(xué)和信息科學(xué)的理論、方法和技術(shù)研究生物大分子，建立各種計算模型，對實驗生物學(xué)中產(chǎn)生的大量生物學(xué)數(shù)據(jù)進行收集、存儲、集成、查詢、處理及分析，揭示蘊含在這些數(shù)據(jù)中的豐富內(nèi)涵，發(fā)現(xiàn)生物分子信息的組織規(guī)律，從而掌握復(fù)雜的生命現(xiàn)象包括生命起源、生物進化以及細胞、器官和個體的發(fā)生、發(fā)育、病變、衰亡的規(guī)律和時空聯(lián)系。組織芯片的制作流程主要包括組織篩選和定位、陣列蠟塊的制作和切片等步驟r岡17—1． 組織芯片的特點是體積小、信息含量大，并可根據(jù)不同的需求進行組合制成各種組織芯片，能高效、快速和低消耗地進行各種組織學(xué)的原位研究和觀察，如形態(tài)學(xué)、免疫組織化學(xué)、原位雜交和原位PcR等，并有較好的內(nèi)對照及實驗條件的可比性。檢測容量已達一萬三千多個點，并實現(xiàn)了整個過程全自動化檢測，具有高效率、低成本的特點，尤其適合于蛋白表達的大規(guī)模、多種類篩查，并能用于受體一配體、多種感染因素的篩查和腫瘤的診斷。應(yīng)用基因芯片技術(shù)要求實驗材料是從新鮮組織或培養(yǎng)細胞中提取的mRNA，對外周血或培養(yǎng)細胞樣本的研究相對容易．對實體瘤的研究受到一定限制?；蛐酒瑱z測的基本原理(圖17—10)是：用不同的熒光染料通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將不同組織的mR_NA分別標記制成探針，將探針混合后與芯片上的DNA片段進行雜交、洗滌，然后用特有的熒光波長掃描芯片，得到這些基因在不同組織或細胞中的表達譜圖片，再通過計算機分析出這些基因在不同組織的表達差異。即將大量靶基因或寡核苷酸片段有序、高密度地(點與點間距一般小于5 0【)168。 CGf{技術(shù)的優(yōu)點是：①實驗所需樣本DNA量較少，做單一的一次雜交即可檢查腫瘤全基因組的染色體拷貝數(shù)量的變化；②該方法不僅適用于外周血、培養(yǎng)細胞和新鮮組織樣本的研究，還可用于甲醛固定石蠟包埋組織樣本的研究，也可用于因DNA量過少而經(jīng)PcR擴增的樣本研究。隨著電子計算機技術(shù)的發(fā)展，形態(tài)定量技術(shù)已從二維空問向三維空間發(fā)展。應(yīng)注意的是單細胞懸液樣本的質(zhì)量直接影響FcM檢測結(jié)果，一般而言，新鮮細胞或組織樣本優(yōu)于已固定的組織樣本。樣本制備基本原則是：①保持各種體液和懸浮細胞樣本新鮮，盡快完成樣本的制備和檢測；②針對不同的細胞樣本進行適當(dāng)?shù)南礈?、酶消化或EDTA處理，以清除雜質(zhì)，使黏附的細胞彼此分離而成單細胞狀態(tài)；③對新鮮實體瘤組織可選用或聯(lián)合使用酶消化法、機械打散法和化學(xué)分散法來獲得有足夠細胞數(shù)量的單細胞懸液。 (一)流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)和工作原理 ． 流式細胞儀由三部分構(gòu)成：①傳感系統(tǒng)，包括樣本遞送系統(tǒng)、樣品池、監(jiān)測系統(tǒng)、電子傳感器和激光源等；②計算機系統(tǒng)；③電路、光路和水路系統(tǒng)，有電源、光學(xué)傳導(dǎo)和濾片、鞘液循環(huán)和回收部分等?？赡墚a(chǎn)生假陽性的原因有引物擴增序列的彌散、引物與模板的錯配等。由于使用原位雜交技術(shù)對擴增產(chǎn)物進行檢測，使該方法的特異性較直接法原位PCIR．．高。PCR．是在體外經(jīng)酶促反應(yīng)將某一特定DNA序列進行高效、快速擴增，它可將單一拷貝或低拷貝的待測核酸以指數(shù)的形式擴增而達到常規(guī)方法可檢測的水平，但不能進行組織學(xué)定位。 (四)原位雜交技術(shù)的應(yīng)用 原位雜交可應(yīng)用于：①細胞特異性mR．NA轉(zhuǎn)錄的定位．如基因圖譜、基因表達和基因組進化的研究；②受感染組織中病毒DNA／RNA的檢測和定位，如EB病毒mRNA、人類乳頭狀瘤病毒DNA(圖17—7)和巨細胞病毒DNA的檢測；③癌基因、抑癌基因及各種功能基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達及其變化的檢測；④基因在染色體上的定位；⑤染色體變化的檢測，如染色體數(shù)量異常和染色體易位等：⑥分裂間期細胞遺傳學(xué)的研究，如遺傳病的產(chǎn)前診斷和某些遺傳病基因攜帶者的確定，某些腫瘤的診斷等。直接法FIsH是以熒光素直接標記已知DNA探針，所檢測的靶序列為DNA。主要程序包括雜交前準備、預(yù)處理、雜交、雜交后處理一清洗和雜交體的檢測等。探針標記物有放射性和非放射性之分，前者如放射性核素，H、。IsH的生物化學(xué)基礎(chǔ)是DNA變性、復(fù)性和堿基互補配對結(jié)合。LscM主要使用直接或間接免疫熒光染色和熒光原位雜交技術(shù)。 (一)LSCM的主要功能 LscM的主要功能有：①細胞、組織光學(xué)切片：利用計算機及圖像處理系統(tǒng)對組織、細胞及亞細胞結(jié)構(gòu)進行斷層掃描，該功能也被形象地稱為“細胞CT”或“顯微CT”(圖17—5)；②三維立體空間結(jié)構(gòu)重建；③對活細胞的長時間觀察；④細胞內(nèi)酸堿度及細胞離子的定量測定；⑤熒光漂白恢復(fù)技術(shù)(1]uol 第五節(jié) 激光掃描共聚焦顯微技術(shù) 激光掃描共聚焦顯微鏡(1aser scanning confocal microscope，LSCM)是近代生物醫(yī)學(xué)圖像分析儀器研究最重要的成就之一，它是將光學(xué)顯微鏡、激光掃描技術(shù)和計算機圖像處理技術(shù)相結(jié)合而形成的高技術(shù)設(shè)備。EVA膜放入試管內(nèi)經(jīng)蛋白酶消化使細胞與膜分開，同時也將細胞裂解，獲得待提取物質(zhì)．如DNA、RNA和蛋白質(zhì)等。激光束從切片的上方垂直照射下來。另外，用于顯微切割的組織切片還必須染色，以便于進行目標細胞群或單一細胞的定位。odissection)是20世紀90年代初發(fā)展起來的一門新技術(shù)，它能夠從組織切片或細胞涂片上的任一區(qū)域內(nèi)切割下幾百個、幾十個同類細胞，甚至單個細胞(圖17—4)。隨著電鏡技術(shù)的，不斷發(fā)展以及與其他方法
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