17-病理學(xué)常用技術(shù)的原理及應(yīng)用(編輯修改稿)
2024-08-31 07:45 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 對其擴散速率進行監(jiān)測。FRAP可用于細胞間通訊、細胞骨架的構(gòu)成、生物膜結(jié)構(gòu)和大分子組裝等的研究；⑥細胞間通訊的研究；⑦細胞膜流動件測定和光活化技術(shù)等。 (二)LSCM對樣本的要求及其局限性 用于LscM的樣本最好是培養(yǎng)細胞樣本，如培養(yǎng)細胞涂片或細胞爬片，也可以是冷凍組織切片．石蠟包埋組織切片不適用于該技術(shù)。LscM主要使用直接或間接免疫熒光染色和熒光原位雜交技術(shù)。熒光標記的探針或抗體的質(zhì)量將直接影響實驗的結(jié)果。 第六節(jié)核酸原位雜交技術(shù) 原位雜交(in situ hVbridizacion，IsH)是核酸分子雜交的一部分，是將組織化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合以檢測和定位核酸的技術(shù)。它是用標記了的已知序列的核苷酸片段作為探針(probe)，通過雜交直接在組織切片、細胞涂片或培養(yǎng)細胞爬片上檢測和定位某一特定靶DNA或RNA的存在。IsH的生物化學(xué)基礎(chǔ)是DNA變性、復(fù)性和堿基互補配對結(jié)合。根據(jù)所選用的探針和待檢測靶序列的不同，有I)NA—DNA雜交、DNA—RNA雜交和RNA—RNA雜交。 (一)探針的選擇和標記 用于原位雜交的探針有雙鏈cDNA探針、單鏈cDNA探針、單鏈cRNA探針以及合成的寡核苷酸探針等。一般而言，探針的長度以50～30(3bp為宜，用于染色體原位雜交的探針可為1．2～1．5kb。探針標記物有放射性和非放射性之分，前者如放射性核素，H、。ss、印等，這類探針的敏感性高，但有半衰期及放射性污染，成本高且耗時等缺陷，故其使用受到限制；非放射性探針標記物有熒光素、地高辛和生物素等．盡管其敏感性不如放射性標記探針，但因其性能穩(wěn)定、操作簡便、成本低和耗時短等長處，正越來越廣泛地得到應(yīng)用。雙鏈cDNA探針的標記可用缺口平移法或隨機引物法；單鏈cRNA探針可通過轉(zhuǎn)錄進行標記；合成的寡核苷酸探針可用5’末端標記法，即加尾標記法。 (二)原位雜交的主要程序 原位雜交的實驗材料可以是常規(guī)石蠟包埋組織切片、冷凍組織切片、細胞涂片和培養(yǎng)細胞爬片等。主要程序包括雜交前準備、預(yù)處理、雜交、雜交后處理一清洗和雜交體的檢測等。操作中應(yīng)注意的問題有：①對DNA—RNA雜交和RNA—RNA雜交．需進行滅活RNA酶處理，包括用0．5％o的二乙基焦碳酸鹽(diethylpyrocalbonate，【)EPC)水配制有關(guān)試劑和160～180℃烘烤實驗用器皿等；當使用雙鏈cDNA探針和(或)待測靶序列是DNA時，需進行變性處理使DNA解鏈；②雜交溫度應(yīng)低于雜交體的解鏈溫度(Tm)25~(2左右；③對照實驗：原位雜交遠較免疫組化染色復(fù)雜，影響因素頗多，故對照實驗必不可少，有組織對照、探針對照、雜交反應(yīng)體系對照和檢測系統(tǒng)的對照等，可根據(jù)具體情況選用。 (三)熒光原位雜交(flLlorescence in situ hVbr_dization。FISH) 可以用直接法或間接法進行FIsH。直接法FIsH是以熒光素直接標記已知DNA探針，所檢測的靶序列為DNA。間接法：FISt{是以非熒光標記物標記已知DNA探針．再橋連一個熒光標記的抗體。用于FIsH的探針有不同的類型，如重復(fù)序列探針、位點特異性探針和全染色體探針等，目前已有大量商品化的熒光標記探針，使F：[St{技術(shù)得到越來越廣泛的應(yīng)用。FIsH的實驗材料可以是問期細胞、分裂中期的染色體，也可以是冷凍或石蠟切片組織(圖17—6)。 (四)原位雜交技術(shù)的應(yīng)用 原位雜交可應(yīng)用于：①細胞特異性mR．NA轉(zhuǎn)錄的定位．如基因圖譜、基因表達和基因組進化的研究；②受感染組織中病毒DNA／RNA的檢測和定位，如EB病毒mRNA、人類乳頭狀瘤病毒DNA(圖17—7)和巨細胞病毒DNA的檢測；③癌基因、抑癌基因及各種功能基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達及其變化的檢測；④基因在染色體上的定位；⑤染色體變化的檢測，如染色體數(shù)量異常和染色體易位等：⑥分裂間期細胞遺傳學(xué)的研究，如遺傳病的產(chǎn)前診斷和某些遺傳病基因攜帶者的確定，某些腫瘤的診斷等。原位雜交與免疫組化染色技術(shù)相比較．IHc使用的是抗體．其檢測對象是抗原，機制是抗原一抗體的特異性結(jié)合，是蛋白質(zhì)表達水平的檢測；IsH使用的是探針．遵循堿基互補配對的原則，與待檢測的靶序列結(jié)合，是DNA或轉(zhuǎn)錄(mRNA)水平的檢測。兩者均有較高的敏感性和特異性，但IsH更容易受到外界因素的影響。 第七節(jié)原位多聚酶鏈式反應(yīng)技術(shù) 原位多聚酶鏈式反應(yīng)技術(shù)是多聚酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reactl’orl，PcR)技術(shù)的一部分。PCR．是在體外經(jīng)酶促反應(yīng)將某一特定DNA序列進行高效、快速擴增，它可將單一拷貝或低拷貝的待測核酸以指數(shù)的形式擴增而達到常規(guī)方法可檢測的水平，但不能進行組織學(xué)定位。原位PcR(in situ PcR)技術(shù)是將PcR的高效擴增與原位雜交的細胞及組織學(xué)定位相結(jié)合，在冷凍切片或石蠟包埋組織切片、細胞涂片或培養(yǎng)細胞爬片上檢測和定位核酸的技術(shù)。 (一)原位PCR技術(shù)方法 原位PcR技術(shù)有直接法原位PcR、間接法原位PcR、原位反轉(zhuǎn)錄PcR(in situ re—vel_se transcl’iption—PcR， in Sl‘ttl RT—PcR)和原位再生式序列復(fù)制反應(yīng)(self—sLtstained se—quence replication reactl‘orl，3SP．．)等方法，其中應(yīng)用相對較為廣泛的是間接法原位PcR。其主要程序有：組織固定、預(yù)處理(如蛋白酶K和RNA酶消化)、原位擴增及擴增產(chǎn)物的原位雜交和檢測等。由于使用原位雜交技術(shù)對擴增產(chǎn)物進行檢測，使該方法的特異性較直接法原位PCIR．．高。 (二)原位PCR技術(shù)的應(yīng)用及存在的問題 原位PcR技術(shù)可對低拷貝的內(nèi)源性基因進行檢測和定位，在完整的細胞樣本上能檢測出單一拷貝的DNA序列，可用于基因突變、基因重排等的研究和觀察。還可用于外源性基因的檢測和定位，如對各種感染性疾病
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