轉(zhuǎn)染技術(shù)原理及應(yīng)用-閱讀頁(yè)
2024-08-02 22:42本頁(yè)面
【正文】 生素細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中往往會(huì)添加抗生素來(lái)防止污染，但是這些添加劑可能對(duì)轉(zhuǎn)染造成麻煩。這些抗生素一般對(duì)于真核細(xì)胞無(wú)毒，但有些轉(zhuǎn)染試劑增加了細(xì)胞的通透性，使抗生素可以進(jìn)入細(xì)胞。目前轉(zhuǎn)染試劑因?yàn)槿潭伎梢杂糜醒搴涂股氐忍砑觿┑耐耆囵B(yǎng)基來(lái)操作，非常方便，省去了污染等麻煩。（6）DNA質(zhì)量DNA質(zhì)量對(duì)轉(zhuǎn)染效率影響非常大。核酸純化世界第一品牌德國(guó)QIAGEN公司提供的超純質(zhì)粒抽提試劑盒，能達(dá)到兩倍2CsCl梯度離心以上的純度效果，使您不必為DNA質(zhì)量操心。但如果使用GenEscort轉(zhuǎn)染試劑，一般不需要這么高的DNA質(zhì)量要求。4．載體構(gòu)建轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建（病毒載體，質(zhì)粒DNA，RNA，PCR產(chǎn)物，寡核苷酸等）也影響轉(zhuǎn)染結(jié)果。除載體構(gòu)建外，載體的形態(tài)及大小對(duì)轉(zhuǎn)染效率也有不同的影響，如前面提到的超螺旋及線性DNA對(duì)瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的影響。轉(zhuǎn)染技術(shù)的要點(diǎn)及轉(zhuǎn)染試劑正確選擇轉(zhuǎn)染技術(shù)的要點(diǎn)及轉(zhuǎn)染試劑正確選擇轉(zhuǎn)染技術(shù)是指將外源分子如DNA，RNA等導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)，它是研究基因表達(dá)調(diào)控，突變分析等的常規(guī)工具。以下就向大家介紹一些轉(zhuǎn)染的技術(shù)要點(diǎn)及市面上主要的轉(zhuǎn)染試劑類型的選擇。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個(gè)宿主細(xì)胞中可存在多個(gè)拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動(dòng)子和其它調(diào)控元件的分析。后者也稱穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/104轉(zhuǎn)染細(xì)胞能整合，通常需要通過(guò)一些選擇性標(biāo)記，如來(lái)氨丙基轉(zhuǎn)移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。不同細(xì)胞有不同的培養(yǎng)基，血清和添加物。高的轉(zhuǎn)染效率需要一定的細(xì)胞密度，一般的轉(zhuǎn)染試劑都會(huì)有專門的說(shuō)明。一定要避免細(xì)菌，支原體或真菌的污染。胎牛血清（FCS）經(jīng)常用到，便宜一點(diǎn)的有馬或牛血清。血清質(zhì)量的變化直接影響轉(zhuǎn)染效率。有些轉(zhuǎn)染技術(shù)如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染在有血清存在情況下效率很低，因此在轉(zhuǎn)染前要除血清。3. 載體構(gòu)建轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建（病毒載體，質(zhì)粒DNA，RNA，PCR產(chǎn)物，寡核苷酸等）也影響轉(zhuǎn)染結(jié)果。除載體構(gòu)建外，載體的形態(tài)及大小對(duì)轉(zhuǎn)染效率也有不同的影響，如前面提到的超螺旋及線性DNA對(duì)瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的影響。4. DNA質(zhì)量DNA質(zhì)量對(duì)轉(zhuǎn)染效率影響非常大。核酸純化世界第一品牌德國(guó)QIAGEN公司提供的超純質(zhì)粒抽提試劑盒，能達(dá)到兩倍2x CsCl梯度離心以上的純度效果，使您不必為DNA質(zhì)量操心。轉(zhuǎn)染技術(shù)的選擇對(duì)轉(zhuǎn)染結(jié)果影響也很大，許多轉(zhuǎn)染方法需要優(yōu)化DNA與轉(zhuǎn)染試劑比例，細(xì)胞數(shù)量，培養(yǎng)及檢測(cè)時(shí)間等。電穿孔法高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜電位，DNA通過(guò)膜上形成的小孔導(dǎo)入 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染，所有細(xì)胞 適用性廣但細(xì)胞致死率高，DNA和細(xì)胞用量大，需根據(jù)不同細(xì)胞類型優(yōu)化電穿孔實(shí)驗(yàn)條件 陽(yáng)離子性的脂質(zhì)體法帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染，所有細(xì)胞 適用性廣，轉(zhuǎn)染效率高，重復(fù)性好但轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清轉(zhuǎn)染效果隨細(xì)胞類型變化大 病毒介導(dǎo)法逆轉(zhuǎn)錄病毒 通過(guò)侵染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，特定宿主細(xì)胞 可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、原代細(xì)胞，體內(nèi)細(xì)胞等，但攜帶基因不能太大細(xì)胞需處分裂期，需考慮安全因素 ，腺病毒 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，特定宿主細(xì)胞 可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，需考慮
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