轉(zhuǎn)染技術(shù)原理及應(yīng)用(編輯修改稿)
2024-08-10 22:42 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 而演化。這會(huì)導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化。也就是說同一種系的細(xì)胞株，在各實(shí)驗(yàn)室不同培養(yǎng)條件下，其生物學(xué)性狀發(fā)生不同程度的改變，導(dǎo)致其轉(zhuǎn)染特性也發(fā)生變化。因此，如果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率降低，可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞以恢復(fù)最佳結(jié)果。3．轉(zhuǎn)染方法不同轉(zhuǎn)染試劑有不同的轉(zhuǎn)染方法，但大多大同小異。轉(zhuǎn)染時(shí)應(yīng)跟據(jù)具體轉(zhuǎn)染試劑推薦的方法，但也要注意，因不同實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的細(xì)胞性質(zhì)不同，質(zhì)粒定量差異，操作手法上的差異等，其轉(zhuǎn)染效果可能不同，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的具體條件來確定最佳轉(zhuǎn)染條件。（1）細(xì)胞培養(yǎng)物健康的細(xì)胞培養(yǎng)物是成功轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)。不同細(xì)胞有不同的培養(yǎng)基，血清和添加物。高的轉(zhuǎn)染效率需要一定的細(xì)胞密度，一般的轉(zhuǎn)染試劑都會(huì)有專門的說明。推薦在轉(zhuǎn)染前24小時(shí)分細(xì)胞，這將提供正常細(xì)胞代謝，增加對(duì)外源DNA攝入的可能。一定要避免細(xì)菌，支原體或真菌的污染。（2）細(xì)胞密度細(xì)胞密度對(duì)轉(zhuǎn)染效率有一定的影響。不同的轉(zhuǎn)染試劑，要求轉(zhuǎn)染時(shí)的最適細(xì)胞密度各不相同，即使同一種試劑，也會(huì)因不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異。轉(zhuǎn)染時(shí)過高或者過低的細(xì)胞密度會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低，乃至表達(dá)水平偏低。因此如果選用新的細(xì)胞系或者新的轉(zhuǎn)染試劑，最好能夠進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)并為以后的實(shí)驗(yàn)建立一個(gè)穩(wěn)定方法，包括適當(dāng)?shù)慕臃N量和培養(yǎng)時(shí)間等等。陽離子脂質(zhì)體具有微量的細(xì)胞毒性而往往需要更高的鋪板密度或者更多的懸浮細(xì)胞數(shù)，有的要求細(xì)胞90%匯片；而有些多胺或者非脂質(zhì)體的配方則要求在40%80%之間，總之是盡量在細(xì)胞最適的生理狀態(tài)下轉(zhuǎn)染，以求最佳的轉(zhuǎn)染效果。不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊矔?huì)影響轉(zhuǎn)染時(shí)的鋪板密度，比如研究細(xì)胞周期相關(guān)基因等表達(dá)周期長的基因，就需要較低的鋪板密度，所以需要選擇能夠在較低鋪板密度下進(jìn)行轉(zhuǎn)染的試劑。一般轉(zhuǎn)染時(shí)貼壁細(xì)胞密度為50%90%，但這個(gè)需要參考所選轉(zhuǎn)染試劑的說明書。（3）血清血清一度曾被認(rèn)為會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率，老一代的轉(zhuǎn)染方法往往要求轉(zhuǎn)染前后洗細(xì)胞或者在無血清培養(yǎng)基條件下轉(zhuǎn)染，但有些對(duì)此敏感的細(xì)胞如原代細(xì)胞會(huì)受到損傷，甚至死亡導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率極低。不過轉(zhuǎn)染產(chǎn)品配方幾經(jīng)革新后的今天，對(duì)于主流的轉(zhuǎn)染試劑來說，血清的存在已經(jīng)不會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率，甚至還有助于提高轉(zhuǎn)染效率，如陽離子聚合物等，血清的存在會(huì)影響DNA—轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成，但只要在DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物形成時(shí)用無血清培養(yǎng)基或PBS來稀釋DNA和轉(zhuǎn)染試劑就可以了，在轉(zhuǎn)染過程中是可以使用血清的。不過要特別注意：對(duì)于RNA轉(zhuǎn)染，如何消除血清中潛在的RNase污染是值得關(guān)注的。胎牛血清（FCS）經(jīng)常用到，便宜一點(diǎn)的有馬或牛血清。通常的，血清是一種包含生長因子及其它輔助因子的不確切成分的添加物，對(duì)不同細(xì)胞的生長作用有很大的差別。血清質(zhì)量的變化直接影響細(xì)胞生長，因此也會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率。新加培養(yǎng)基的預(yù)熱對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染很有幫助。（4）抗生素細(xì)胞培養(yǎng)過程中往往會(huì)添加抗生素來防止污染，但是這些添加劑可能對(duì)轉(zhuǎn)染造成麻煩。比如青霉素和鏈霉素，就是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些抗生素一般對(duì)于真核細(xì)胞無毒，但有些轉(zhuǎn)染試劑增加了細(xì)胞的通透性，使抗生素可以進(jìn)入細(xì)胞。這可能間接導(dǎo)致細(xì)胞死亡，造成轉(zhuǎn)染效率低。目前轉(zhuǎn)染試劑因?yàn)槿潭伎梢杂糜醒搴涂股氐忍砑觿┑耐耆囵B(yǎng)基來操作，非常方便，省去了污染等麻煩。（5）氮磷（N/P）比N/P比是轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵（為了換算方便，一般以DNA/轉(zhuǎn)染試劑質(zhì)量比表示），在一定比例范圍內(nèi)轉(zhuǎn)染效率隨N/P比成比例增高，之后達(dá)到平值，但毒性也隨之而增加，因此在實(shí)驗(yàn)之前應(yīng)根據(jù)推薦比例，確定本實(shí)驗(yàn)的最佳轉(zhuǎn)染比例。
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