pcr技術(shù)的原理、操作及應(yīng)用-文庫(kù)吧資料
2025-01-25 08:14本頁(yè)面
【正文】 未知 RNA或 5 ul 陽性對(duì)照或 Rnasefree water作為陰性對(duì)照。 PCR技術(shù)的操作 2 ? 1. 病毒核酸 RNA提取 ? 2. RTPCR反應(yīng)或者 Realtime RTPCR反應(yīng) ? 3. UV紫外燈檢測(cè)或者電腦上直接讀取結(jié)果 流感病毒核酸提取 1 試驗(yàn)材料 ? QIAGEN公司的 Rneasy Mini Kit (或 QIAGEN公司的 QIAmp Viral RNA Mini Kit，操作類似 ) ? β巰基乙醇（ βmercaptoethanol） ? 70% 乙醇 ? 無菌及 DNA,RNA酶的 離心管 ? 10μl、 20μl、 200μl、 1000μl加樣器和槍頭 ? 可調(diào) 13K微型冷凍離心機(jī) ? 待檢流感病毒 200μl 流感病毒核酸提取 2 ? 取采樣液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培養(yǎng)物（雞胚尿囊液或細(xì)胞培養(yǎng)液） 200ul加在 Eppendorf管中 ? 依次加入 350ul RLT液、 70%的乙醇 550ul混勻 ? 將 Rneasy mini spin柱子置于干凈的 2ml收集管上，將 2步驟的混合液 600ul吸出加入柱子中， 12， 000rpm，離心 15秒，棄收集管中的離心液 ? 柱子仍放回收集管上，將 2步驟剩余的混合液全部吸到柱子上， 12，000rpm，離心 15秒，棄離心液 ? 于柱子中加入 700ul Wash Buffer RW1液， 12， 000rpm，離心 15秒 ? 取一支干凈的 2ml收集管，將離心后的柱子移到新的收集管上，于柱子中加入 500ul Wash Buffer RPE液， 12， 000rpm，離心 15秒 ? 棄收集管中的離心液，再于柱子中加入 500ul Wash Buffer RPE液，13， 00014， 000rpm，離心 2分鐘 ? 將柱子移到一干凈的 eppendrof管上，于柱子中加入 2050ul的 Rnasefree Water，室溫靜置 13分鐘 ? 12， 000rpm，離心 1分鐘，收集離心液即為提取的病毒 RNA，立即做實(shí)驗(yàn)或 20℃ 以下保存 ? 試劑盒為 QIAGEN公司的 RNeasy Mini Kit （ catalog 74104） ? 注意：試劑盒中的 RPE液用前需加 44ml 的無水乙醇，使終體積達(dá)到 55ml。操作時(shí)避免氣溶膠產(chǎn)生，特別注意陽性樣品的拿放，使用一次性耗材，穿戴手套并經(jīng)常更換，永遠(yuǎn)在最后一步才加核酸，液體分裝使用等。 ? PCR技術(shù)擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度有限。 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR的原理 3 ? Ct與初始模板的關(guān)系 ? 固定循環(huán)數(shù)后，熒光信號(hào)與模板數(shù)成正比 ? 初始 DNA量越多 , 熒光達(dá)到閾值時(shí)所需要的循環(huán)數(shù) (Ct 值 )越少 ? 起始模板的對(duì)數(shù)濃度與 Ct呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品的 Ct值就可計(jì)算出樣品中所含的模板量 14 16
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