[醫(yī)藥衛(wèi)生]基因擴增技術pcr(已修改)
2025-04-03 06:52 本頁面
【正文】 Polymerase Chain Reaction 聚合酶鏈反應 （ PCR） Polymerase chain reaction又稱無細胞分子克隆系統(tǒng)或特異性 DNA序列體外引物定向酶促擴增法 ， 在 模板 DNA， 引物（ 模板兩端的已知序列 ） 和 四種脫氧核苷酸 存在的情況下 ， DNA聚合酶依賴的酶促合成反應 。 PCR的定義 PCR技術是由 Cetus公司和加利福利亞大學 1985年聯(lián)合創(chuàng)造的 ， 主要貢獻者為 Kary B mulis和 HeneryA、 Erlich。 可將極微量的靶 DNA特異地 擴增上百萬倍 ， 能檢測每 10萬個細胞 中僅含 一個 靶 DNA分子 的樣品 。 因而發(fā)明人 Kary B、 mulis獲 1993年諾貝爾化學獎 。 1993年獲諾貝爾化學獎 PCR的種類 ? amp。 RTPCR ? (關于熱啟動 ， 一般要求把反映體系加好后 ， 最好立即開始反映 ，這時就要安排好時間 ， 最好先把機器開好 ， 等到 85度以上 ， 把體系加進去 ， 這樣就會防止引物 2聚體 ！ 一般引物 2聚體的形成溫度為 60度左右 ！ 超過了此溫度就可有效防止其形成 。 ） ? amp。 反向 PCR ? amp。 不對稱 PCR ? amp。 多重 PCR ? amp。 巢式 RTPCR ? amp。 實時定量熒光 PCR PCR溫度循環(huán)參數(shù) ? 變性 (denature)溫度和時間 模板 DNA的變性：模板 DNA雙鏈在 9396加熱 2’10’解離；經(jīng) PCR擴增形成的雙鏈 DNA在 9396176。 C 加熱 30”1’。 ? 退火 (anneal)溫度和時間 : Tm5176。 C 溫度降至 55C左右 ， 特異引物與模板 D N A單鏈配對結合 。 ? 延伸 (extend)溫度和時間： 72176。 C 1000堿基 /分鐘 在 TagDNA聚合酶的作用下 ， 以 dNTP為反應原料 ， 靶序列為模 板，引物為起始點，按堿基配對原理合成一條新的復制鏈。 ? 循環(huán)數(shù) 在 25~30個循環(huán)內(nèi) ， 擴增的 DNA量增加明顯 ， 然后進入平臺期 。 靶序列的初始濃度越低，所需循環(huán)數(shù)越高。 PCR擴增效率（理論） 以上三步為一個循環(huán) 。 每一循環(huán)的產(chǎn)物可以作為下一個循環(huán)的模板 ， 從理論上講 ， 每經(jīng)過一循環(huán) ， 樣本中的 DNA量應該增加一倍 ，擴增 DNA產(chǎn)量是以指數(shù)形式上升的 ， 既 n個循環(huán)后 ， 產(chǎn)量為 2n， 經(jīng)過 2530個循環(huán)后 DNA可擴增 106109倍 。 PCR擴增效率（實際） 實際上 ， PCR擴增效率比理論值要低 。 對于不同的基因來 說，擴增效率也大不相同。 (如圖所示 ) 經(jīng)過一定循環(huán)數(shù)之后 ， PCR產(chǎn)物的量增長緩慢 ， 進入所謂的“ 平臺期 ” ， 在 PCR擴增反應達到平臺期前 ， 模板擴增產(chǎn)物 (N) 與啟始模板 (N0) 之間呈下列方程所示關系 : N = N0 ? (1+E) n 其中 E是擴增效率， n是循環(huán)數(shù)。 演示 PCR反應的過程！ PCR反應體系組成 （ 1） DNA模板 （ 2） 引物 （ 3） dNTP （ 4） 耐熱的 DNA聚合酶 （ 5） 10 PCR緩沖液 (含 Mg++) 模板核酸 ? PCR可以以 DNA或 RNA為模板進行核酸的體外擴增。 ? RNA的擴增必須經(jīng)逆轉錄成 cDNA后才能進行正常的 PCR循環(huán)，稱為 RTPCR。 ? PCR反應中模板加入量一般為 10
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