rt-pcr實(shí)驗(yàn)心得(已修改)
2025-09-01 05:32 本頁(yè)面
【正文】 RTPCR 實(shí)驗(yàn)心得 ■ 提取 RNA(我做細(xì)胞的 ) (100ml 培養(yǎng)瓶 注 :此時(shí)細(xì)胞匯合度 ≥ 80%),用 PBS 洗細(xì)胞兩次，棄盡 PBS 后加 2mlTRIzol（量大無(wú)防！ ） , 細(xì)胞用用吹打管吹至液體澄清且無(wú)細(xì)胞團(tuán)塊 轉(zhuǎn)至 2 個(gè) 管中 . 10 下，室溫 5 分鐘 . 2 個(gè) EP 管中各加入 ml 氯仿。蓋緊樣品管蓋，用手用力搖晃試管 15 秒并將其在 30176。C 下孵育 2—3 分鐘。 2—8176。C 下用不超過(guò) 12,000 g 的離心力高速冷凍離心 15 分鐘。離心后混合物分成三層：下層紅色的苯酚 氯仿層，中間層，上層無(wú)色的水樣層。 （約 500600μl）于另二個(gè) 管中 ,加等體積異丙醇（約 500600μl），混勻室溫 10 分鐘來(lái)沉淀 RNA→ 在 2— 8176。C 下以不超過(guò)12,000 g 的離心力高速冷凍離心 10 分鐘。 注 :移液槍的槍頭不宜伸入液面太深 ,以防洗上中層液體 !。離心前注意放管的方向 ,此時(shí) RNA沉淀形成一膠狀片狀沉淀附著于試管壁和管底。 ,用 75%的乙醇 (用 DEPC 水處理的 ,臨時(shí)十分鐘配 ,預(yù)冷保存于 4176。C 或20176。C) 1 ml 來(lái)洗滌 RNA 沉淀 → 在 2—8176。C 下以不超過(guò) 7,500 g 的離心力高速冷凍離心 5 分鐘。 。離心 前注意放管的方向 , 注 :旋渦振蕩混合樣品 。RNA 在 75%乙醇中， 28℃ 至少可保存一周， 20℃ 至少可保存一年 ! 7 棄上清，置于衛(wèi)生紙上，自然晾干（不能完全干燥） ,用 2050μl DEPC 水溶解。(建議裝于 的 EP 管中 .) 8 紫外光度檢測(cè) 注 :該步后 ,可保存于 70℃超低溫冰箱 ,或算好計(jì)量建立體系立即用于逆轉(zhuǎn)錄 . ■ RT 反應(yīng)體系注意事項(xiàng) 試劑盒中試劑解凍后 , 搖晃試管使其均勻 ,在稍離心 ,放于冰盒上 .反應(yīng)也在冰上操作 . 2 PCR 儀預(yù)熱到 50176。C,在放 PCR 管于 PCR 儀上 (之前在冰上 !)開(kāi)始逆轉(zhuǎn)錄 . 3 反應(yīng)體系準(zhǔn)備 :比原體系 大 10%。建立 25ul 的反應(yīng)體系 。先按 總反應(yīng)體系混合 總體體系反應(yīng)物 ,在 分裝于 PCR 管中 (分裝前宜離心 !),再分別加 RNA 和引物 /內(nèi)參 。 4 RNA 的量宜大 2ug/reaction! 5 要有要有逆轉(zhuǎn)錄 (50℃ ,30min)和初始熱活化 (95℃ , 15 min)。 ■ Reac
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