pcr污染與對策(編輯修改稿)
2024-09-26 00:05 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 ，至少 PCR 操作過程中加樣器應(yīng)該專用，不能交叉使用，尤其是 PCR 產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區(qū)； 8. 重復(fù)實驗，驗證結(jié)果，慎下結(jié)論。 二． 追蹤污染源 如果不慎發(fā)生污染情況，應(yīng)從下面幾條出發(fā)，逐一分析，排除污染。 （一）設(shè)立陰陽性對照：有利于監(jiān)測反應(yīng)體系各成分的污染情況。選擇陽性對照時，應(yīng)選擇擴增弱，且重復(fù)性好的樣品，因強陽性對照可產(chǎn)生大量不必要的擴增序列，反而可能成為潛在的污染源。如果以含靶序列的重組質(zhì)粒為對照， 100 個拷貝之內(nèi)的靶序列就足以產(chǎn)生陽性擴增。陰性對照的選擇亦要慎重， 因為 PCR 敏感性極高，可以從其它方法（ Sourthern 印跡或點雜交等）檢測陰性的標(biāo)本中檢測出極微量的靶分子。此外，每次擴增均應(yīng)包括 PCR 體系中各試劑的時機對照，即包括 PCR 反應(yīng)所需的全部成分，而不加模板DNA，這對監(jiān)測試劑中 PCR 產(chǎn)物殘留污染是非常有益的。如果擴增結(jié)果中試劑對照為陽性結(jié)果，就是某一種或數(shù)種試劑被污染了。此時，要全部更換一批新的試劑進行擴增，擴增時設(shè)立不同的反應(yīng)管，每一管含有一種被檢測試劑，在檢出污染試劑后，應(yīng)馬上處理。 （二）環(huán)境污染：在排除試劑污染的可能性外，更換試劑后，若不久又發(fā)現(xiàn) 試劑被污染了，如果預(yù)防措施比較嚴密，則考慮可能為環(huán)境污染。 環(huán)境污染中常見的污染源主要有： 1. 模板提取時真空抽干裝置； 2. 凝膠電泳加樣器； 3. 電泳裝置； 4. 紫外分析儀； 5. 切膠用刀或手術(shù)刀片； 6. 離心機； 7. 冰箱門把手，冷凍架，門把手或?qū)嶒炁_面等； 此時可用擦拭實驗來查找可疑污染源。 1）用無菌水浸泡過的滅菌棉簽擦拭可疑污染源； 2） 去離子水浸泡； 3）取 5ml 做 PCR 實驗； 4）電泳檢測結(jié)果。 8. 氣溶膠。如果經(jīng)過上述追蹤實驗，仍不能查找到確切污染源，則污染可能是由空氣中 PCR 產(chǎn)物的氣溶膠造成的，此時就應(yīng)該更換實驗場所，若條件不允許，則重新設(shè)計新的引物（與原引物無相關(guān)性）。 三．污染處理 （一）環(huán)境污染 1. 稀酸處理法：對可疑器具用 1mol/L 鹽酸擦拭或浸泡，使殘余 DNA脫嘌呤； 2. 紫外照射（ UV）法：紫外波長（ nm）一般選擇 254/300nm，照射 30min 即可。需要注意的是，選擇 UV作為消除殘留 PCR 產(chǎn)物污染時，要考慮 PCR 產(chǎn)物的長度與產(chǎn)物序列中堿基的分布， UV 照射僅對 500bp 以上長片段有效，對短片段效果不大。 UV 照射時， PCR 產(chǎn)物中嘧啶堿基會形成二聚體，這些 二聚體可使延伸終
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