【正文】 從樣品稀釋到平板涂布整個(gè)試驗(yàn)過程要求在20min內(nèi)完成。根據(jù)樣品中所含乳酸菌的種類選擇培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，見表1，每一種培養(yǎng)條件的每個(gè)稀釋度作兩個(gè)平皿。，按上述操作順序，做10倍遞增樣品勻液，每遞增稀釋一次，即換用1次1mL滅菌吸管或吸頭。：液體樣品應(yīng)先將其充分搖勻后以無菌吸管吸取樣品25mL放人裝有225mL生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分振搖，制成1：10的樣品勻液。℃—5℃條件下解凍，時(shí)間不超過18h，也可在溫度不超過45℃的條件下解凍，時(shí)間不超過15min。 %麥芽糖發(fā)酵管：. %甘露醇發(fā)酵管：. %水楊苷發(fā)酵管：. %山梨醇發(fā)酵管：. %乳酸發(fā)酵管：. . 革蘭氏染色液:6 檢驗(yàn)程序乳酸菌檢驗(yàn)程序見圖1。給出這一信息是為了方便本標(biāo)準(zhǔn)的使用者，并不表示對(duì)該產(chǎn)品的認(rèn)可。 %纖維二糖發(fā)酵管：。 MC（modified chalmers）培養(yǎng)基：。 無菌錐形瓶：500mL、250mL、5 培養(yǎng)基和試劑 API 50CH生化鑒定試劑盒①。 無菌試管：18mm180mm、15mm100mm 。 均質(zhì)器及無菌均質(zhì)袋、均質(zhì)杯或滅菌乳體。1℃。4 設(shè)備和材料 除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下。 乳酸菌 lactic acid bacteria 一類可發(fā)酵糖主要產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的通稱。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。2 規(guī)范性引用文件 下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。 GIi/T －2008食品中乳酸菌檢驗(yàn)1 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了含乳酸菌食品中乳酸菌（lactic acid bacteria）的檢驗(yàn)方法。 表5 沙門氏菌屬各生化群的鑒別項(xiàng)目ⅠⅡⅢⅣⅤⅥ衛(wèi)矛醇++——+—山梨醇+++++—水楊苷———+——ONPG——+—+—丙二酸鹽—++———氰化鉀（KCN）———++— 注：+表示陽(yáng)性—表示陰性。ONPG陰性為沙門氏菌，同時(shí)賴氨酸脫羧酶陽(yáng)性，甲型副傷寒沙門氏菌為賴氨酸脫羧酶陰性。 5. 4. 2. 2 反應(yīng)序號(hào)A2：補(bǔ)做甘露醇和山梨醇試驗(yàn)，沙門氏菌靛基質(zhì)陽(yáng)性變體兩項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性，但需要結(jié)合血清學(xué)鑒定結(jié)果進(jìn)行判定。按表4可判定為沙門氏菌。如尿素。5℃或室溫至少保留24 h，以備必要時(shí)復(fù)查。1℃培養(yǎng)18 h~24 h，必要時(shí)可延長(zhǎng)至48 h，按表3判定結(jié)果。 5. 4. 2接種三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫竣酶試驗(yàn)培養(yǎng)基的同時(shí)，可直接接種蛋白陳水(供做靛基質(zhì)試驗(yàn))、尿素瓊脂(pH7. 2) ,氰化鉀(KCN)培養(yǎng)基，也可在初步判斷結(jié)果后從營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落接種。 GB/T －2008 表2說明，在三糖鐵瓊脂內(nèi)斜面產(chǎn)酸，底層產(chǎn)酸，同時(shí)賴氨酸脫梭酶試驗(yàn)陰性的菌株可以排除。+(一)多數(shù)陽(yáng)性，少數(shù)陰性。接種針不要滅菌，直接接種賴氨酸脫梭酶試驗(yàn)培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，于36℃士1℃培養(yǎng) 18 h~24 h，必要時(shí)可延長(zhǎng)至48 h。有些菌株為黃色，中心黑色或幾乎全黑色 XLD瓊脂 菌落呈粉紅色，帶或不帶黑色中心，有些菌株可呈現(xiàn)大的帶光澤的黑色中心，或呈現(xiàn)全部黑色的菌落。于36℃士1℃分別培養(yǎng)18 h~24 h (XLD瓊脂平板、HE瓊脂平板、科瑪嘉顯色培養(yǎng)基平板)或40 h~48 h (BS瓊脂平板)，觀察各個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落，各個(gè)平板上的菌落特 表1沙門氏菌屬在不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征 選擇性瓊脂平板 沙門氏菌 BS瓊脂菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色。無菌操作將樣品轉(zhuǎn)至500 ml錐形瓶中，如使用均質(zhì)袋，可直接進(jìn)行培養(yǎng)，于36℃士1℃培養(yǎng)8h~18 h 如為冷凍產(chǎn)品，應(yīng)在45℃以下不超過15 min，或2℃ ^}5℃不超過18 h解凍。若樣品 為液態(tài)，不需要均質(zhì)，振蕩混勻。1℃18h~24H36℃177。1℃18h~24H36℃177。 4檢驗(yàn)程序 沙門氏菌檢驗(yàn)程序見圖1 檢樣25g(ml)+225mlBPW=1ml+TTP 10ml1ml+SC 10mlBSXLD(或HE、科瑪嘉顯色培養(yǎng)基)挑取可疑菌落TSI ，賴氨酸，營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA），靛基質(zhì)，尿素（PH ）,氰化鉀（KCN）商品化生化鑒定系統(tǒng)H2S+靛基質(zhì)尿素KCN賴氨酸+H2S+靛基質(zhì)+尿素KCN賴氨酸+H2S靛基質(zhì)尿素KCN賴氨酸+/反應(yīng)結(jié)果與左側(cè)描述不符甘露醇+、山梨醇+ONPG沙門氏菌，血清學(xué)試驗(yàn)非沙門氏菌報(bào)告36℃177。 3. 17 沙門氏菌O和H診斷血清。 3. 15 半固體瓊脂:見第A. 1 4章。 GB/T －2008 3. 13 糖發(fā)酵管:見第A. 12章。給出這一信息是為了方便本標(biāo)準(zhǔn)的使用者，并不表示對(duì)該產(chǎn)品的認(rèn)可。如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，則可使用這些等效的產(chǎn)品。 ⑴由法國(guó)生物梅里埃公司提供的產(chǎn)品的商品名。 3. 1 1 氰化鉀(KCN)培養(yǎng)基:。 3. 9 蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑:見第A. 8章。 3. 6 木糖賴氨酸脫氧膽鹽XLD)瓊脂:見第A. 6章。 3. 4 亞硫酸秘(BS)瓊脂:見第A. 4章。 3. 2 四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液:。 2. 1 1 p H計(jì)或PH比色管或精密pH試紙。感量0. 1 g 2. 6 無菌錐形瓶:容量500 ml,250 ml 2. 7 無菌吸管:1 ml(具0. 0lml，刻度),10 ml()或微量移液器及吸頭。 2. 4 振蕩器。 2設(shè)備和材料 除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下。 沙門氏菌檢驗(yàn) 1. 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中沙門氏菌的檢驗(yàn)方法。稀釋液：，用蒸餾水稀釋至1000ml，分裝于適宜容器中，121℃高壓滅菌15min。使用前臨時(shí)制備，不得超過3h。A. 制法將上述成分溶解于蒸餾水中，調(diào)解PH。報(bào)告單位以CFU/g（或CFU/mL）表示。則計(jì)數(shù)稀釋度最低的測(cè)試片上的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告；如果所有稀釋度的測(cè)試片上均無菌落生長(zhǎng)，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告；如果最高稀釋度的菌落數(shù)大于150，計(jì)數(shù)最高稀釋度的測(cè)試片上的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告。10. 3 大腸菌群測(cè)試片計(jì)數(shù)的報(bào)告 選取菌落數(shù)在15～150之間的測(cè)試片，計(jì)數(shù)其紅色有氣泡的菌落數(shù)，兩個(gè)測(cè)試片的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)即為每克（或毫升）樣品中的大腸菌群菌落形成單位（CFU）數(shù)。圓形培養(yǎng)區(qū)邊緣上及邊緣以外的菌落不作計(jì)數(shù)。2h 后應(yīng)立即計(jì)數(shù)，可目測(cè)或用標(biāo)準(zhǔn)菌落計(jì)數(shù)器、放大鏡或PetrifilmTM 自動(dòng)判讀儀來計(jì)數(shù)。2h。將測(cè)試片的透明面朝上置于培養(yǎng)箱內(nèi)，堆疊片數(shù)不超過20片，36℃177。把壓板（平面底朝下）放置在上層膜中央，輕輕地壓下，使樣液均勻覆蓋于圓形的培養(yǎng)面積上，切勿扭轉(zhuǎn)壓板。 測(cè)定 樣品接種及培養(yǎng)將待檢樣品選取2個(gè)～3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種兩張測(cè)試片。 第三法 大腸菌群PetrifilmTM測(cè)試片法9 檢驗(yàn)程序 大腸菌群PetrifilmTM測(cè)試片法的檢驗(yàn)程序見圖3檢樣25g（或25mL）樣品＋225mL稀釋液，均質(zhì)10倍系列稀釋選擇2個(gè)～3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液，接種PetrifilmTM測(cè)試片36℃＋1℃ 24h177。 大腸菌群平板計(jì)數(shù)的報(bào)告 ，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每克（每毫升）樣品中大腸菌群數(shù)。1℃培養(yǎng)24 h～48h，觀察產(chǎn)氣情況。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)。1℃培養(yǎng)18h～24h。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3mL～4mL VRBA覆蓋平板表層。同時(shí)分別取1mL生理鹽水加入兩個(gè)無菌平皿作空白對(duì)照。2h圖 2 大腸菌群平板計(jì)數(shù)的檢驗(yàn)程序GB/—20088 操作步驟 樣品的稀釋 。 第二法 大腸菌群平板計(jì)數(shù)7 檢驗(yàn)程序 大腸菌群平板計(jì)數(shù)的檢驗(yàn)程序見下圖 2檢樣25g（或25mL）樣品＋225mL稀釋液，均質(zhì) 10倍系列稀釋選擇2個(gè)～3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液，接種VRBA平板 36℃＋1℃ 48h177。2h，觀察產(chǎn)氣情況。2h內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種與煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯管中，36℃177。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性，產(chǎn)氣者則進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。2h。 初發(fā)酵試驗(yàn) 每個(gè)樣品，選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個(gè)稀釋度接3管月桂基硫酸鹽胰蛋白（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯），36℃177。美遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸管或吸頭。 用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1：10樣品勻液1mL，巖管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或用1支1mL無菌吸管反復(fù)吹打，使其混合均勻，制成1：100的樣品勻液。 液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品，置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶?jī)?nèi)與之適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，置盛1：10的樣品勻液。2h不產(chǎn)氣 產(chǎn)氣 BGLB肉湯 36℃＋1℃ 48h177。 1mol/L鹽酸（Hcl）：移取農(nóng)鹽酸90mL,用蒸餾水稀釋至1000mL Petrifilm?大腸菌群檢驗(yàn)測(cè)試片和壓板。GB/－2008 無菌生理鹽水：，121℃高壓滅菌15min?！? Pctrifilm tm是由3M公司提供的產(chǎn)品的商品名，給出這一個(gè)薪資是為了方便本標(biāo)準(zhǔn)的使用者，并不表示對(duì)該產(chǎn)品的認(rèn)可。結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（violet red bile agar，VRBA）：。4 培養(yǎng)基和試劑月桂基硫酸鹽胰蛋白棟（lauryl sulfate tryptose，LST）肉湯：。 pH計(jì)或pH比色管或精密pH試紙。 無菌錐形瓶：容量500mL。 振蕩器。 天平：。 恒溫水浴箱：46℃177。1℃。最可能數(shù) most probable number；MPN基于泊松分布的一種間接計(jì)數(shù)方法。 大腸菌群 coliforms 一群在36℃條件下培養(yǎng)48h能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于各類食品中大腸菌群的計(jì)數(shù)。 稀釋液： mL，用蒸餾水稀釋至l 000 mL，分裝于適宜容器中，121℃高壓滅菌15 min。10 結(jié)果的表述同第7章附錄A(規(guī)范性附錄)培養(yǎng)基和試劑A 1 平板計(jì)數(shù)瓊脂(plate count agar，PcA)培養(yǎng)基A 1 1成分 胰蛋白胨 g 酵母浸膏 g 葡萄糖 g 瓊脂 g 蒸餾水 1 000 mL pH A 1 2制法 將上述成分加于蒸餾水巾A 2磷酸鹽緩沖液A 2 1成分 磷酸二氫鉀(KH2P04) 蒸餾水 PH A 2 2制法GB／T 4789 2—2∞8煮沸溶解，調(diào)節(jié)PH。 某些微生物會(huì)液化凝膠，造成局部擴(kuò)散或菌落模糊的現(xiàn)象。細(xì)菌濃度很高時(shí)，整個(gè)測(cè)試片會(huì)變成紅色或粉紅色，將結(jié)果記錄為“多不可計(jì)”。選取菌落數(shù)在30 300 之間的測(cè)試片計(jì)數(shù)?？啥询B至20 片， 。每個(gè)稀釋度接種兩張測(cè)試片。將測(cè)試片置于平坦實(shí)驗(yàn)臺(tái)表面，揭開上層膜，用吸管或微量移液器吸取1 mL 樣品勻液，垂直滴加在測(cè)試片的中央，將上層膜蓋下，允許上層膜直接落下，但不要滾動(dòng)上層膜，將壓板（凹面底朝下）放置在上層膜中央，輕輕地壓下，使樣液均勻覆蓋于圓形的培養(yǎng)膜上，切勿扭轉(zhuǎn)壓板。9 操作步驟 樣品的稀釋 制備1:10 的樣品勻液后，用1 mol/L 氫氧化鈉（NaOH ）或1 mol/L 鹽酸( HCL ）調(diào)節(jié)pH 。 稱重取樣以CFU/g為單位報(bào)告，體積取樣以CFU/ml為單位報(bào)告。 若所有平板上蔓延菌落而無法計(jì)數(shù)，則報(bào)告菌落蔓延。 菌落總數(shù)的報(bào)告，按“四舍五入”原則修約，采用兩位有效數(shù)字報(bào)告。，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)數(shù)（包括液體樣品原液）的平板均無菌落數(shù)生成，則以少于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)數(shù)。