【正文】 38。同時接種不含纖維素的培養(yǎng)基作對照。(2)方法二：平皿測試法％％的瓊脂。接種時，應有不接種的空白作對照。紙條寬度以易于放入試管為宜，紙條長度約57cm。 (3)器材：平皿、接種環(huán)、新華一號濾紙。 (2)培養(yǎng)基：無機鹽基礎培養(yǎng)基： ，CaCl ，K2HP04 ，F(xiàn)eCl3 ，KH2PO4 ，MgS04在液體培養(yǎng)基中的濾紙條被分解后發(fā)生斷裂或失去原有物理性狀；在固體培養(yǎng)基上，細菌降解濾紙可以形成水解斑，從而可以判斷細菌能否分解纖維素。 有些細菌具有分解纖維素的能力，可以分泌纖維素酶，使纖維素水解。(2) 在分離真菌時為什么需加鏈霉素(慶大霉素或氯霉素)，而不加青霉素?(3) 自己設計選用細菌和霉菌抑制劑代用品進行比較試驗，并進行結果分析?！? (6)菌種保存：將分離到的真菌轉接到PDA斜面上培養(yǎng)，待長好后置于冰箱中保存，必要時進行深入研究。(4)挑菌純化：從長有單菌落的千板中選取典型的真菌菌落(包括酵母菌菌落)轉接斜面，并同時制片作純度檢查，若不純，應進一步挑取該菌落采用劃線分離，或制成菌懸液進一步作稀釋分離，直至獲得純培養(yǎng)體為止。2)涂抹法：按“稀釋平板計數(shù)法”中的“涂抹平板計數(shù)法”進行，所不同的是稀釋度，應選1010103三個稀釋度進行接種。 (2)分離方法：采用稀釋平板分離法。 (1)培養(yǎng)基：加有氯霉素(或慶大霉素)和孟加拉紅的馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基(在1000ml培養(yǎng)基中加入注射用氯霉素2mL，均于滅菌前加入)，其配方如下： (2)器材：無菌平皿、lmL無菌吸管、9mL無菌水、酒精燈、玻璃刮鏟。本實驗采用加有氯霉素或慶大霉素(按一般資料介紹為鏈霉素，但此種抗生素要先配成一定濃度的溶液，且應于倒平板前才加入培養(yǎng)基中)和孟加拉紅的馬丁氏培養(yǎng)基分離及計數(shù)菜園土中的真菌。 真菌在土壤中的數(shù)量次于細菌和放線菌，主要在有機質豐富、透氣性好的偏 酸性土壤中較多。(3)自己設計選用細菌和霉菌抑制劑代用品進行比較試驗，并進行結果分析。(1)計數(shù)：選取每皿放線菌菌落數(shù)為30300的平板進行計數(shù)(應注意剔除混在其中的細菌菌落和霉菌菌落)。(3)培養(yǎng)：將上述接種過土壤懸液的平板倒置于28—30℃培養(yǎng)45d。又可分為：①混菌法：按“稀釋平板計數(shù)法”中的“混合平板培養(yǎng)法”進行，所不同者是稀釋度，應采用1010105三個稀釋度，各做3個重復。在稀釋時，可在盛無菌水的三角瓶中加10滴lOOg/L的石炭酸溶液和50ug／m1的制霉菌素以抑制細菌和霉菌的生長。 (3)器材：無菌吸管、無菌平皿、無菌水、接種環(huán)、酒精燈。 (1)材料：肥沃茶園土。 放線菌與細菌同屬原核微生物，是重要的抗生素產生菌，在土壤中的數(shù)量僅次于細菌，尤其是在有機質豐富、透氣性好的中性到微堿性土壤中的數(shù)量較多。(2)挑選有代表性的菌落涂片，做革蘭氏染色，記錄細菌的形態(tài)和革蘭氏染色的反應性。 注：土壤含水量的測定是將一定質量的土壤在105110℃下烘干至恒重，再稱干重。 (5)計數(shù)：選取混菌法和涂抹法中每皿菌落數(shù)在30300的平板，分別按“稀釋平板測數(shù)法”中的“混合平板測數(shù)法”和“涂抹平板測數(shù)法”中的公式計數(shù)。 (3)培養(yǎng)：將上述接種過土壤懸液的平板倒置，于2830℃培養(yǎng)，至長出菌落為止(2436h)。 以上各種分離法，都應按無菌操作進行。轉動培養(yǎng)皿1800，再從平板另一邊(不燒接種環(huán))同樣劃線至平板中央（見圖13）。同法進行第三次、第四次劃線。劃線可按以下兩種方式進行：一種為交叉劃線法，是在乎板的一邊做第一次“Z”字形劃線。 以上兩法又統(tǒng)稱為稀釋平板分離法，可同時用于所分離菌的計數(shù)。 (2)分離方法：①混菌法按“稀釋平板測數(shù)法”中的“混合平板培養(yǎng)法”進行，使用的稀釋度為1010106三個，各做3個重復。(1)培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(、 g、NaCl5 g、水1000ml、) (2)器材：菜園土(經2mm土壤篩過篩)、90mL無菌水(內裝玻璃珠15～20個)1瓶、9mL無菌水6支、lmL無菌吸管、直徑9cm的無菌干皿、天平、試管架、無菌稱量紙、酒精燈、火柴、接種環(huán)、玻璃刮鏟、記號筆等。分離微生物常用的方法有稀釋平板分離法和劃線分離法，根據(jù)不同的材料，可以采用不同方法，其最終目的是要在培養(yǎng)基上出現(xiàn)欲分離微生物的單個菌落，必要時再對單菌落進一步分離純化。本實驗以菜園土為材料分離土壤中的好氣性細菌，并進行數(shù)量測定。土壤中的微生物數(shù)量與種類主要與土壤肥力有關，肥沃的土壤中多，貧瘠土壤中少。為了研究某種微生物的特性或者要大量培養(yǎng)和使用某種微生物，必須從這些混雜的微生物群落中獲得純培養(yǎng)，這種獲得純培養(yǎng)的方法稱為微生物的分離與純化。 (2)學會用劃線法分離微生物。若同時用平板計數(shù)法測定，所繪出的生長曲線與用比濁法測定繪出的生長曲線有何差異？為什么？3根據(jù)實驗數(shù)據(jù)畫出生長曲線，并說明大腸桿菌生長特征。思考題 1值為縱坐標，繪制大腸桿菌的生長曲線。 2. 六、實驗結果 1.然后分別按對應時間將三角瓶取出，立即放冰箱中貯存，待培養(yǎng)結束時一同測定OD值。取盛有50mL無菌肉膏蛋白胨培養(yǎng)液的250mL三角瓶11個，分別編號為0、11120h。 2標記編號 大腸桿菌 培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 實驗儀器和器：721分光光度計，比色杯，恒溫搖床，無菌吸管，試管，三角瓶。 三、實驗材料 菌種：測定微生物的數(shù)量有多種不同的方法，可根據(jù)要求和實驗室條件選用。 這四個時期的長短因菌種的遺傳性、接種量和培養(yǎng)條件的不同而有所改變。它反映了單細胞微生物在一定環(huán)境條件下于液體培養(yǎng)時所表現(xiàn)出的群體生長規(guī)律。學習用比濁法測定細菌的生長曲線一、實驗目的 1：將平皿置于28℃下培養(yǎng)48h后觀察結果。：將滅菌濾紙片浸入供試藥劑中吸取藥液，然后將濾紙片取出（將藥液瀝干），然后將濾紙片平鋪于平板上，并在平板上做標記。：取無菌水2支，用接種環(huán)分別取大腸桿菌和枯草桿菌各2環(huán)接入無菌水，充分混勻制成菌懸液。：無菌平皿、無菌水、無菌吸管、玻璃刮鏟、無菌鑷子、無菌圓形濾紙片。三、實驗器材：：大腸桿菌、枯草桿菌斜面菌種。因此在實際生活中常用化學藥物進行殺菌。實驗十四 抗生素對微生物的作用一、實驗目的：了解抗生素對微生物的殺滅作用。結果觀察：觀察平板上是否有紙形圖案的細菌生長圖。：紫外燈先預熱15min，將已經接種的平板置于紫外燈下（平皿距紫外燈1米），打開皿蓋，紫外線照射30min，取出黑紙，蓋上皿蓋。三、實驗材料 菌種：枯草桿菌 培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨瓊脂平板四、 實驗步驟：取無菌水（5ml）一瓶，以接種環(huán)取枯草桿菌菌種2環(huán)，混合均勻，制成懸液。二、基本原理紫外線對微生物有誘發(fā)突變和致死作用，因紫外線照射劑量不同而異，低劑量用于微生物誘變育種，高劑量用于實驗室或工作間消毒殺菌。 每克樣品的菌數(shù)=同一稀釋度幾次重復的菌落平均數(shù)10稀釋倍數(shù)實驗十三 紫外線對微生物生長的影響一、實驗目的要求1了解紫外線對微生物生長的影響與作用機制。選擇好計數(shù)的稀釋度后，即可統(tǒng)計在平板上長出的菌落數(shù)，統(tǒng)計結果按下式計算。 1g樣品活菌數(shù) 平均平均12五、實驗作業(yè)：① 描述所看到的微生物菌落形態(tài)，一般從它們在形態(tài)、大小、色澤、透明度、致密度和邊緣等特征上的差異進行描述。在由低濃度向高濃度涂抹時，也可以不更換刮鏟。 涂抹平板計數(shù)法與混合法基本相同，所不同的是先將培養(yǎng)基熔化后趁熱倒入無菌平板中，待凝固后編號，（每個編號設三個重復）。至長出菌落后即可計數(shù)。 將無菌平板編上1010109號碼，每一號碼設置三個重復，用無菌吸管按無菌操作要求吸取109稀釋液各1ml放入編號109的3個平板中，同法吸取108稀釋液各lml放入編號108的3個平板中，再吸取107稀釋液各lml放入編號107的3個平板中（由低濃度向高濃度時，吸管可不必更換）。 平板接種培養(yǎng)有混合平板培養(yǎng)法和涂抹平板培養(yǎng)法兩種方法。通常測定細菌菌劑含菌數(shù)時，采用1010109稀釋度，測定土壤細菌數(shù)量時，采用1010106稀釋度，測定放線菌數(shù)量時，采用l010105稀釋度，測定真菌數(shù)量時，采用1010104稀釋度。圖 平板計數(shù)法中樣品的稀釋和稀釋液的取樣培養(yǎng)用稀釋平板計數(shù)時，待測菌稀釋度的選擇應根據(jù)樣品確定。三、 實驗材料蘇云金芽孢桿菌、放線菌及霉菌菌液，牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，高氏一號培養(yǎng)基，PDA培養(yǎng)基；器材：無菌水，無菌平皿，1ml無菌吸管，記號筆，玻璃刮鏟等。此法所計算的菌數(shù)是培養(yǎng)基上長出來的菌落數(shù)，故又稱活菌計數(shù)。計數(shù)時，首先將待測樣品制成均勻的系列稀釋液，盡量使樣品中的微生物細胞分散開，使成單個細胞存在（否則一個菌落就不只是代表一個細胞），再取一定稀釋度、一定量的稀釋液接種到平板中，使其均勻分布于平板中的培養(yǎng)基內。二、實驗原理 (三)器材 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,培養(yǎng)皿(6套一包),手提式高壓蒸氣滅菌鍋等.(四)操作步驟 ,再向外層鍋內加入適量的水,使水面與三角擱架相平為宜. 切勿忘記加水,同時水量不可過少,以防滅菌鍋燒干而引起炸裂事故. ,以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞. ,使螺栓松緊一致,勿使漏氣. ,并同時打開排氣閥,關上排氣閥,控制熱源,℃,20min滅菌.,才能關上排氣閥,維持所需壓力. ,切斷電源或關閉煤氣,讓滅菌鍋內溫度自然下降,當壓力表的壓力降至0時,打開排氣閥,旋松螺栓,打開蓋子,取出滅菌物品.壓力一定要降到0時,才能打開排氣閥,使容器內的培養(yǎng)基由于內外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口,造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染,甚至灼傷操作者.,需擺斜面的則擺成斜面,然后放入37℃溫箱培養(yǎng)24h,經檢查若無雜菌生長,即可待用.(五)實驗報告 檢查培養(yǎng)基滅菌是否徹底. (1) 高壓蒸氣滅菌開始之前,為什么要將鍋內冷空氣排盡 滅菌完畢后,為什么待壓力降低0時才能打開排氣閥,開蓋取物 (2) 在使用高壓蒸氣滅菌鍋滅菌時,怎樣杜絕一切不安全的因素 (3) 滅菌在微生物實驗操作中有何重要意義 (4) 黑曲霉的孢子與芽孢桿菌的孢子對熱的抗性哪個最強 為什么三,紫外線滅菌 (一) 目的要求了解紫外線滅菌的原理和方法 (二) 基本原理~300nm的紫外線都有殺菌能力,由于輻射能使空氣中的氧電離成[O],再使O2氧化生成臭氧(O3)或使水(H2O)氧化生成過氧化氫(H2O2).,所以,只適用于無菌室,接種箱,.此外,為了加強紫外線滅菌效果,在打開紫外燈以前。 。 。 。 (三)器材 培養(yǎng)皿,試管,吸管,電烘箱等. (四)操作步驟 將包好的待滅菌物品(培養(yǎng)皿,試管,吸管等)放入電烘箱內,關好箱門. 物品不要擺得太擠,以免妨礙空氣流通,滅菌物品不要接觸電烘箱內壁的鐵板,以防包裝紙烤焦起火. 接通電源,撥動開關,打開電烘箱排氣孔,旋動恒溫調節(jié)器至綠燈亮,℃時,如果紅燈熄滅,綠燈亮,表示箱內停止加溫,此時如果還未達到所需的160—170℃溫度,則需轉動調節(jié)器使紅燈再亮,如此反復調節(jié),直至達到所需溫度. 當溫度升達到160～170℃時,恒溫調節(jié)器會自動控制調節(jié)溫度,保持此溫度2h. . 切斷電源,自然降溫. 待電烘箱內溫度降到70℃以下后,打開箱門,取出滅菌物品. 電烘箱內溫度末降到70℃,切勿自行打開箱門以免驟然降溫導致玻璃器皿炸裂. (五)實驗報告 思考題 ,為什么 ,時間要長 請設計干熱滅菌和濕熱滅菌效果比較實驗方案. 二 高壓蒸氣滅菌 (一)目的要求 . . (二)基本原理 高壓蒸氣滅菌是將待滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內,通過加熱,然后關閉排氣閥,繼續(xù)加熱,此時由于蒸氣不能溢出,而增加了滅菌鍋內的壓力,從而使沸點增高,得到高于100℃. 在同一溫度下,:一是濕熱中細菌菌體吸收水分,蛋白質較易凝固,因蛋白質含水量增加,所需凝固溫度降低(表2—1),二是濕熱的穿透力比干熱大,℃時,(千焦),能迅速提高被滅菌物體的溫度,從而增加滅菌效力. 在使用高壓蒸氣滅菌鍋滅菌時,滅菌鍋內冷空氣的排除是否完全極為重要,因為空氣的膨脹壓大于水蒸氣的膨脹壓,所以,當水蒸氣中含有空氣時,在同一壓力下,壓力與溫度的關系見(表2—2) 表2—2 滅菌鍋留有不同分量空氣時,壓力與溫度的關系 壓力表讀數(shù)/Pa滅菌器內溫度/℃未排除空氣排除1/3空氣排除1/2空氣排除2/3空氣完全排除空氣357290941001097090100105109115105100109112115