【導讀】本研究以本課題組轉育的大白菜雄性不育兩用系“AB01”為材料，要求盡量收集第一手資料，資料要真實、可靠、有代表性。要求條理清晰，數(shù)據(jù)分析詳盡。要求貼近主題，有參考價值。4認真撰寫論文，字數(shù)在10000字以上。由于其花器官小，單花結籽少，而單。關基因、揭示大白菜核基因雄性不育分子機理奠定?？捎仓甑钠渌课患安挥仓曛芯鶝]有表達。不同等級大小花蕾中的時序表達結果顯示，各等級。只在雄蕊中表達，而在其他花器官組織中均不表達。表明該基因為大白菜花蕾發(fā)育調控基因，它對。育性控制發(fā)生在花蕾發(fā)生初期就已起作用。。并且其基因可能與雄。內外白菜的優(yōu)良品種已絕大部分為一代雜種。力下降的難題，但是在生產(chǎn)雜種時拔除母本行50%的可育株，增加了育苗成本，此外，如可育株拔除不徹底，使雜交率降低，種子質量得不到保證。植物不能產(chǎn)生功能花藥、花粉或雄配子的現(xiàn)象稱雄性不育[3]。

　　

【正文】 CR方法調查了 BFAPG基因的表達差異變化 ，重復 3次 。結果發(fā)現(xiàn) , ACTIN基因在所有的不育及可育植株的各等級花蕾中中均有相似表達，而目的基因 BFAPG僅在 雄蕊 中有表達， 而在花器官的其它部位均無表達 （圖 10） ，表明該基因為 雄蕊特異表達基因 。 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 500bp 250bp 500bp 250bp 500bp 250bp 500bp 250bp BFAPG ACTIN BFAPG ACTIN M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 500bp 250bp 500bp 250bp BFAPG ACTIN 沈陽農(nóng)業(yè)大學學士學位畢業(yè)論文 17 圖 7 BFAPG 與 ACTIN 基因在 花器官不同部位 中 的表達。 M:Marker。 13：花萼的 3 個重復 ； 46：花瓣的 3 個重復； 79：雄蕊的 3 個重復；1012：雌蕊的 3 個重復 討論 RNA 提取 保證 RNA 的產(chǎn)量和純度及措施對于構建 cDNA 文庫，模 板 RNA 的質量直接影響到 cDNA 合成的效率，分離純 化 RNA 的關鍵在于消除 RNase 對 RNA 的 降解，提高 RNA的 產(chǎn)量純度?？?RNA 的濃度應達 到 ng／ μl，以 上為好，否則，合成的 dscDNA 產(chǎn)量低，達不到建庫的要求。質量較好的 RNA 應 有明顯的 285 和 185 兩 條帶， A260/A28。比值 在 ～ 之 間為好。 要想獲得理想的 RNA 產(chǎn)量 和純度，除防 止 RNase 污染外，還應注意以下幾點 :(l)取下的樣品應立即處理或冷凍 。(2)在液氮中使樣品裂解完全 。(3)操作 時保持低溫 。(4)酚 /氯仿抽提時將水相和有機相之間的變性蛋白去除干凈 。(5)用足量 75%的乙醇洗滌RNA。(6)風干時，不要讓 RNA 顆 粒完全干燥，否則會大大降低它的溶解性 。(7)在去RNase 水中用吸管尖吹打，并可將樣品置于 55 一 60℃下溫育 10min，使 RNA 顆粒溶解完全 。(8)將 RNA 樣品保存于一 70℃ 下 75%的乙醇中。 RNA 通常用分光光度計定量，測量在 260nm 處的吸收值 （ A260） 。通常分光光度計 A260 的 讀數(shù)要介于 之間才是可靠的，因 此 RNA 提取結 束后，要根據(jù)大概產(chǎn)量稀釋到適當濃度 范圍，再用分光光度計測量 。 A260為 1相 當于 RNA的濃度為 40μg/ml。 本部分試驗在 RNA 分 離時使用了 TIANGEN 公司的 離心柱型 RNA 提取 試劑盒，步驟少、省時間、產(chǎn)量高，提取 的 RNA 質量好。 表現(xiàn)為 28S 與 18S 亮度接近 2： 1，OD260/OD280 在 之間（如圖 1）。 BFAPG 基因 的功能預測 根據(jù)全長序列提交 (NCBI)數(shù)據(jù)庫 BLAST 進行序列相似性搜 索，得出此基因與擬南芥胞外脂肪酶有 95%的同源性，與蕓薹屬幾種作物的花粉專一性脯氨酸富集蛋白有 66%的同源性，與玉米花藥專一 性的脯氨酸富集蛋白有有 72%的同源性。因此推斷出此基因可能與脂肪酶基因有關，沈齊（ 20xx 貴州大學）曾在油菜上轉化脂肪酸脫飽和酶基因，在 F2 代產(chǎn)生了約 25%不育株，且花蕾細長，柱頭顯著長于對照，雄蕊退化完全。開花時柱頭先伸出花朵，花瓣小且分離不重疊。其柱頭頂端電鏡觀察豁絨層完好，可正常授粉。根據(jù)比對結果推斷此基因也可能與脯氨酸富集蛋白基因有關，朱廣廉等（ 1984）曾沈陽農(nóng)業(yè)大學學士學位畢業(yè)論文 18 對顯性單基因控制的太谷核不育小麥不同發(fā)育階段的可育株和不育株的花藥及雌蕊說明育性與脯氨酸的含量密切相關。這一現(xiàn)象在小麥、玉米、高梁、洋蔥 ,番茄 ,辣椒和水稻等植物中普遍存在 (Zhang 和 Croes,1983)。 綜上所述此基因是脂肪酸脫飽和酶基因產(chǎn)生的不育性狀還是與脯氨酸富集蛋白基因及其遺傳機理還需進一步實驗驗證。 BFAPG 基因 的功能部位 BFAPG 基因在須根、根、莖、葉、蕾中的 RTPCR 時序表達結果顯示，該基因除在可育花蕾中表達外，可育植株的其它部位及不育植株中均沒有表達。不同等級大小花蕾中的時序表達結果顯示，各等級可育花蕾中均有同等程度的表達，而在不育花蕾中均不表達。表明該基因為大白菜花蕾發(fā)育調控基因，它對育性控制發(fā)生在花 蕾發(fā)生初期就已起作用?？捎ɡ僦谢ㄝ?、花瓣、雄蕊和雌蕊只在雄蕊中表達，而在其他花器官組織中均不表達。說明此基因跟雄蕊的生長 發(fā)育 有關。 劉齊元（ 20xx）煙草游離脯氨酸含量與雄性不育性的關系結果表明 ,花蕾中不育系的脯氨酸含量在小花蕾階段與其保持系非常接近 ,但從中花蕾開始 ,保持系花蕾中的脯氨酸含量急劇上升 ,而不育系花蕾中的脯氨酸含量則基本保持穩(wěn)定 ,因而 ,不育系花蕾中的脯氨酸含量在大花蕾時期明顯低于其保持系 。葉片中生育前期不育系的游離脯氨酸含量和相應保持系之間基本上沒有大的差異 ,僅在生育后期存在一定的差異 ,但這些差 異變化無規(guī)律性。因此 ,花蕾中游離脯氨酸含量與煙草雄性不育性有密切的關系 ,不育系花蕾中脯氨酸含量低是雄性不育性導致的結果 。葉片中游離脯氨酸含量與煙草雄性不育性沒有直接關系。本實驗結果與其基本一致。 3． 2 小結 (一 )以大白菜甲型兩用系 “ AB01“ 不育與可育花蕾為材料，通過抑制差減雜交找到一育性相關基因 ， RTPCR 驗證表明該基因僅在可育花蕾中表達。 （二） 通過結合蕓薹屬多國功能基因組結果獲得該基因的全長序列。 TBLASTX 比對結果顯示該基因屬于 花粉囊專一性的脯氨酸富集蛋白 基因 也可能屬于 脂肪酶 基因 。 這將需 要進行更深入的研究。 （三） 須根、根、莖、葉、蕾中的 RTPCR 時序表達結果顯示，該基因除在可育花蕾中表達外，可育植株的其它部位及不育植株中均沒有表達。不同等級大小花蕾中的時序表達結果顯示，各等級可育花蕾中均有同等程度的表達，而在不育花蕾中均不表達?？捎ɡ僦?花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊只在雄蕊中表達，而在其他花器官組織中均不表達。 表明該基因為大白菜花蕾發(fā)育調控基因，它對育性控制發(fā)生在花蕾發(fā)生初期就已起作用 。 參考文獻 沈陽農(nóng)業(yè)大學學士學位畢業(yè)論文 19 [1]何啟偉 .十字花科蔬菜優(yōu)勢育種 [M].北京 :農(nóng)業(yè)出版社 ,1981. 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Nucleic Acids Res,1994,22(25):56405648 沈陽農(nóng)業(yè)大學學士學位畢業(yè)論文 20 致 謝 學生： 沈陽農(nóng)業(yè)大學本科畢業(yè)論文（設計）承諾書 論文（設計）題目 大白菜核基因雄性不育抑制差減文 庫構建 完成人姓名 史 秀 舉 專業(yè) 園 藝 指導教師姓名 冀 瑞 琴 職稱 副 教 授 本畢業(yè)論文（設計）的創(chuàng)新點： 題在研究方法上較新穎，差減文庫在水稻中研究較多，目前在大白菜上研究的還比較少，本人通過對不育系和可育系兩個品種的分析試驗，并對其進行相關性分析 ,以明確差減文庫在雄性不育上的應用。 承諾內容： 本畢業(yè)論文是本人在導師冀瑞琴老師指導下獨立完成的，沒有抄襲他人成果，對本文的研究作出重要貢獻的個人和集體，均已在文中以明確方式標明。 完成人簽名： 指導教師簽名： 20xx 年 6 月 2 日 20xx 年 6 月 15 日 文 獻 綜 述 題 目： 大白菜核基因雄性不育抑制差減文庫構建 抑制性差減雜交 (SSH)技術及其在大白菜轉育上的應用 摘要 : 白菜原產(chǎn)于我國北方，俗稱大白菜。引種南方，南北各地均有栽培。十九世紀傳入日本、歐美各國。 白菜是人們生活中不可缺少的一種重要 蔬菜 ，味道鮮美可口，營養(yǎng)豐富，素有 “ 菜中之王 ” 的美稱，為廣大群眾所喜愛 [1]。 抑制性差減雜交技術 (SSH)是基于抑制 PCR 作用的 cDNA 差減雜交，是在轉錄水平上研究差異基因表達的技術。該技術在一個循環(huán)過程中完成差異表達基因豐度的均等化及目標群體和對照群體中相同基因的去除，從而實現(xiàn)差異表達基因的高度富集。一個典型的 SSH 過程，可在一個差減雜交過程中將稀有基因序列富集上千倍。本文通過 詳細分析該技術在植物差異表達基因分離中的應用發(fā)現(xiàn)： SSH 技術主要用于分離組織特異性表達和誘導型表達的基因。首先， SSH 技術廣泛應用在分離植物發(fā)育過程中不同發(fā)育階段和不同組織器官中的組織特異性表達的基因，為揭示植物生長發(fā)育過程的分子機理提供了有效手段；另外，在不同植物中，該技術被大量應用于分離各種生物及非生物脅迫條件下誘導表達的抗性相關基因，可以揭示植物抗逆的分子機理。目前， SSH 技術已開始應用于分離與次生代謝產(chǎn)物合成相關的基因。 SSH 技術