【正文】 群體中發(fā)現(xiàn)的那 5 個 QTL 中。 這項 研究針對同一個雜交組合，采用不同的群體和不同的分析方法，定位出相同的 QTL。這有力地證明了 QTL 的真實存在性，同時也說明，至少對效應(yīng)大 QTL 來說，定位的結(jié)果一般是可靠的。許多計算機模擬研究也都表明，只要 QTL能被檢測出（即達到統(tǒng)計顯著水平），則對它的位置估計一般都是比較可靠的，定位結(jié)果一般能夠用于標(biāo)記輔助育種 （ 何小紅， 2021） 。 主要研究內(nèi)容 （ 1）以 高抗大白菜白斑病的大白菜高代自交系 A1543 和高感大白菜白斑病的大白菜高代自交系 P9903為父母本 ，構(gòu)建了 F2 代群體。 （ 2）大白菜白斑病性狀表型及其遺傳特點的研究 （ 3）大白菜 AFLP 分子標(biāo)記分析 （ 4）大白菜分子遺 傳圖譜構(gòu)建 （ 5）大白菜抗白斑病的 QTL 分析 材料與方法 13 2 材料與方法 材料 植物材料 本試驗采用抗病材料 A1543 和感病材 P9903是經(jīng)過多代自交選育的自交系，其中 A1543經(jīng)接種鑒定對白斑病表現(xiàn)高度的抗性，而 P9903 表現(xiàn)出高度感病。抗病材料 A1543 和感病材料 P9903 雜交后代構(gòu)建 F2 分離群體 248 株，用于大白菜分子遺傳圖譜的構(gòu)建。所有材料由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院白菜育種課題組提供。 毒原 2021 年在黑龍江省哈爾濱市香坊農(nóng)場采集分離獲得的白斑病菌 P0811。 主要儀器設(shè)備及藥品 儀器設(shè)備 ： 美國 PTC100TM 型 PCR 儀 、 德國 Biometra TGradient Themoblock 型 PCR 儀 、美國 Beckman 公司低溫臺式高速離心機 、 北京六一廠 DYY6B 型電泳儀 、 gene 凝膠 掃描成像 分析系統(tǒng) 、 CS501A 型水浴鍋 、 美國 CBS 公司 EPS3000IIV 型電泳儀及垂直板凝膠電泳槽 、微量加樣器 （ EppendorfP1000、 P200、 P P P2） 等。 藥品： Taq 酶（ TaKaRa）、 dNTP（ TaKaRa）、 λDNA marker、 DL2021Marker、 三羥甲基氨基甲烷（ Tris）（ Amresco）、 CTAB、 乙二胺四乙酸二鈉鹽（ EDTA）（ Amresco）、氯仿（國產(chǎn)）、異戊醇（國產(chǎn)）、溴化乙錠（ EB）（ Sigma）、溴酚藍（國產(chǎn)）、丙烯酰胺（ Acrylamide）（ Amresco）、甲叉雙丙烯酰胺（ Bis）（ Amresco）、過硫酸銨（ Sigma）、 TEMED（ Amresco）、剝離硅膠（進口）、粘合硅膠（進口）、瓊脂糖（ Agarose）（西班牙）、無水乙醇（國產(chǎn)）、 β 巰基乙醇（進口）、 PVP（德國）、尿素（ Amresco）等。 試驗方法 白斑病 性狀表型及遺傳特點 大白菜苗的培養(yǎng) 將無菌土裝入 10 10cm 的營養(yǎng)缽內(nèi)，灌適量水，土壤完全濕潤后， 分別播種 大白菜 抗感親本各 50 盆 、雜交后 F1 代 50 盆 、 F2 代 248 盆，每盆 5 粒種子，覆土后置于防蟲溫室內(nèi)培養(yǎng)。待幼苗出土后間苗，每盆留大小一致的幼苗一株，常規(guī)管理備用。 接種方法 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)碩士學(xué)位論文 14 當(dāng)幼苗長有 2～ 3 片真葉時進行接種。 在培養(yǎng)基上接白斑病菌，待孢子產(chǎn)生后加入滅菌水，用玻璃將分生孢子洗下，配成孢子懸浮液，用噴霧器噴灑在白菜葉片上，在 25℃條件下保 濕 24 小時后，每天觀察一次，觀察是否發(fā)病及病斑發(fā)展情況。 病情調(diào)查 接種后 1822d 進行病情調(diào)查，記錄病 情 級 別 。病 情 的分級標(biāo)準是按病害癥狀的輕重從09 共分 10 個病級，但通常記載時歸并為 0﹑ 1﹑ 3﹑ 5﹑ 7﹑ 9 級。分級標(biāo)準如下表 21。 表 21 病情分級標(biāo)準 Table 21 Classification standards of Chinese Pseudocercosporalla leaf spot disease 病情級別 Level of disease 癥狀 symptom 0 無癥狀 1 葉片上有較少病斑，病斑占葉面積 10﹪以下； 3 病斑占葉面積的 10﹪以上， 20﹪以下； 5 病斑占葉面積的 20﹪以上， 30﹪以下； 7 病斑占葉面積的 30﹪以上， 40﹪以下； 9 病斑 占葉面積的 40﹪以上至全葉枯死。 F2單株抗性評價指標(biāo) 抗?。?R）﹑中抗（ MR）﹑中感（ MS）﹑感?。?S）表示品種對病害的抗感程度，其劃分因不同病害，乃至不同研究者而異。本試驗按照表 22 的評價標(biāo)準確定 F2單株的抗病程度。 表 22 病害抗性評價標(biāo)準 Table22 Disease score of Chinese cabbage virus disease 抗病程度 Degree of resistance 評價標(biāo)準 Disease Score R DS≤1 MR 1DS≤3 MS 3DS≤5 S 5DS≤9 DNA 的提取 采用 CTAB 方法提取 DNA。 具體步驟如下： （ 1） 取新鮮的嫩葉 1~2g，去掉葉脈。用蒸餾水沖洗干凈，紗布吸干，放入研缽中，加入適量液氮，在保持葉片冷凍的條件下快速將葉片研磨成粉末。 （ 2） 2%CTAB 提取液在 水浴鍋中預(yù)熱至 65℃ 。加熱前在 2%CTAB 提取液中加入 %的巰基乙醇 及 2%的 PVP40。 充分混勻。 （ 3） 冷凍條件下磨碎的樣品快速轉(zhuǎn)入 50ml 滅菌的離心管中，加入 10ml CTAB 緩沖液，材料與方法 15 充分混勻后 65℃ 放置 1h，期間每隔 10min 輕輕搖動一次。 （ 4） 冷卻至室溫后，加入等體積的氯仿：異戊醇（ 24： 1）輕輕轉(zhuǎn)動搖勻。 （ 5） 10000rpm 離心 10min。 （ 6） 用大孔徑的槍頭緩慢吸取上清液，重復(fù) 5步驟，使溶液中蛋白和多糖沉淀充分。 （ 7） 用大孔徑槍頭緩慢吸取上清液，加入已經(jīng)裝有預(yù)冷（ 20℃ ）的 2 倍體積無水乙醇的 50ml 離心管中。輕輕混勻后在 20℃ 靜置 30min，至白色的 DNA 凝結(jié)成絮狀沉淀析出。 （ 8） 勾出 DNA 沉淀于 2ml 的離心管中，加入 1ml 預(yù)冷的 70%的乙醇漂洗 2 次，用無水乙醇漂洗 1 次。置于超凈工作臺上吹干 1~2h。 （ 9） 加入 ~ TE 溶解 DNA，并用 %瓊脂糖凝膠電泳檢測含量。 （ 10） 加滅菌的超純水至 600ul， RNase（ 10mg/ml） 2~3ul，瞬時離心均勻。 37℃ 水浴保溫 1 h。 （ 11） 加入等體積的氯仿：異戊醇（ 24： 1）輕輕轉(zhuǎn)動搖勻。放置 15~30min。在 5℃ ，10000rpm 離心 10min。 （ 12） 用大口徑槍頭緩慢吸取上清液，加入等體積的氯仿：異戊醇（ 24： 1）輕輕轉(zhuǎn)動搖勻。 5℃ 以上， 10000rpm 離心 10min。 （ 13） 用大口徑槍頭緩慢吸取上清液，加入已經(jīng)裝有預(yù)冷（ 20℃ ）的 2 倍體積無水乙醇 ml 離心管中。輕輕混勻后在 20℃ 靜置 30min，至白色 DNA 析出。 （ 14） 在 5℃ ， 10000rpm 離心 10min，加入 1ml 預(yù)冷的 70%的乙醇漂洗 2 次。無水乙醇漂洗 1 次。置于超凈工作臺上吹 1~2h。 （ 15） 加入 TE 溶解 DNA。 20℃ 保存?zhèn)溆谩? （ 16） 取 2ulDNA，以 λDNA為對照進行瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA 的濃度，稀釋為 100 ng/ul 左右 ， 20℃ 保存?zhèn)溆谩? AFLP 分析 酶切連接體系 酶切連接體系中 包括： 100500 ng DNA EcoRI（ 10u/?l） ?l ?l MseI（ 10u/?l） ?l EcoRI adapter（ 5pmol/?l） ?l MseI adapter（ 50pmol/?l） ATP（ 10mM） 10x NEB buffer 2 T4 DNA ligase（ 4unit/?l） 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)碩士學(xué)位論文 16 BSA（ 10mg/ml） MilliQ H2O 總體積 37℃ 水浴 。 預(yù)擴增 預(yù)擴增 體系如下： 酶切連接后模板 ?l EcoRIprimer（ 50 ng/?l） ?l MseIprimer（ 50 ng/?l） ?l dNTPs（ ） ?l 10 x PCR buffer ?l Mg2＋ （ 25mM） Taqpolymerase（ 5units/?l） ?l MilliQ H2O ?l 總體積 ?l PCR 程序： 94℃ 5 min 94℃ 30 sec 56℃ 30 sec 24cycles 72℃ 1 min 72℃ 5 min 取 5?l 產(chǎn)物在 1％ 瓊脂糖凝膠中檢測，較理想的 預(yù) 擴增產(chǎn)物在 50~600bp 之間產(chǎn)生均勻的彌散 。 根據(jù)彌散的亮度確定 預(yù)擴增產(chǎn)物 稀釋的倍數(shù)，通常 將預(yù)擴增產(chǎn)物 稀釋 10~50 倍之間。 選擇性擴增 反應(yīng)體系如下 ： 稀釋后預(yù)擴增產(chǎn)物 ?l MseIprimer（ 50ng/μl ） ?l EcoRIprimer（ 50ng/?l） ?l dNTPs（ ） ?l 10 X buffer ?l Mg2＋ （ 25mM） ?l 材料與方法 17 PCR 程序 ： 94 ?C 5 min 94 ?C 30 sec 65 56 ?C （每循環(huán)下降 ?C） 30 sec Total 12cycles 72 ?C 60 sec 94?C 30 sec 56?C 30 sec Total 24 cycles 72?C 60 sec 72?C 5 min 同樣取 5?l 選擇性擴增 產(chǎn)物在 1％瓊脂糖凝膠中檢測，彌散 條帶中可以看出深淺不一的條帶。 AFLP 電泳和銀染檢測 樣品加入 6μl 的 Loading buffer， 95℃變性 5min，從 PCR 儀中 取 出迅速置于冰上， 防止 DNA 復(fù)性。 然后 在 6％ 聚丙烯酰胺凝膠上 進行 電泳， 75w 恒功率電泳 2h 左右， 待 二甲苯青跑到垂直板的下沿為宜，然后采用銀染法顯色。 具體程序如下： （ 1） 聚丙烯酰胺凝膠的制備 1） 玻璃板的清洗 用清洗液將垂直電泳儀上的兩塊玻璃板洗凈，蒸餾水沖洗后用酒精擦干。 2） 涂板 將配好的 Repel 溶液均勻地涂在短板上， Binding 溶液均勻涂在長板上，室溫放置 20min以上。 3） 灌膠 Taqpolymerase（ 5U/?l） ?l MilliQ H2O ?l 總體積 ?l 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)碩士學(xué)位論文 18 在 75ml 6%聚丙烯酰胺凝膠中加入 375μl 10%過硫酸銨（ APS）、 50μl TEMED，輕輕混勻，灌膠。灌完后，將梳子插 入適當(dāng)位置，將板調(diào)至水平。室溫放置 2h 以上，待膠凝固后用于電泳。 （ 2） 電泳 將玻璃板裝到電泳槽中，上槽緩沖液為 TBE，下槽為 1 TBE 緩沖液 進行電泳。 75W恒功率預(yù)電泳 30 min 后上樣，二甲苯青跑到垂直板的下端 后停止電泳 。 （ 3） 銀染 1） 固定 將玻璃板從電泳槽取下，拔出梳子，將長板和短板分離，將長板取下，放入 2L10%醋酸溶液中浸泡，輕輕搖動 20~30min。 2） 漂洗 取出上板，在蒸餾水中漂洗 2 次，每次 3min。 3） 染色 將上板放入染色液（ 2L 蒸餾水中加入 2g 硝酸銀和 3ml 甲醛）中，染色 30min。 4） 顯影 染色完畢后在蒸餾水中迅速漂洗 3~4s，轉(zhuǎn)入顯影液中（ 2 升蒸餾水中加入 70g 碳酸鈉、3ml 甲醛、 400μl 10mg/ml 的硫代硫酸鈉 ），在搖床上顯影至條帶清晰為止。 5） 終止 將玻璃板取出放入醋酸溶液中，終止 2min 左右。 6） 漂洗 將玻璃板放入蒸餾水中漂洗 10min。 數(shù)據(jù)整理與分析 數(shù)據(jù)記錄 統(tǒng)計 在親本之間產(chǎn)生 的 多態(tài)性并且在群體中有分離的條帶 ， AFLP 標(biāo)記中的共顯性標(biāo)記按顯性標(biāo)記記錄， 與 親 本 A1543 帶型相同者賦值為 A，與 親 本 P9903 帶型相同者賦值為 B，由于 各種原因造成的數(shù)據(jù)不清楚或數(shù)據(jù)缺失者賦值為 “ － ”。 由于我們采用的是 E/M 引物組合，所以 多態(tài)性條帶 用引物編號組合名加多態(tài)性條帶序號表示。由一對引物擴增出多個差異帶的，分別記為引物名加 0 02，依此類推。 圖譜構(gòu)建 應(yīng)用軟件 Mapmaker/ (lander， 1989)進行圖譜的構(gòu)建。利用 “Group”命令進行標(biāo)記間的連鎖分析和分組（ LOD＝ ），連鎖標(biāo)記數(shù)小于 8 個的使用 Compare 命令進行排序，標(biāo)材料與方法 19 記數(shù)大于等于 8 個的要重復(fù)使用 Rippl