【正文】 本文通過 詳細(xì)分析該技術(shù)在植物差異表達(dá)基因分離中的應(yīng)用發(fā)現(xiàn)： SSH 技術(shù)主要用于分離組織特異性表達(dá)和誘導(dǎo)型表達(dá)的基因。 承諾內(nèi)容： 本畢業(yè)論文是本人在導(dǎo)師冀瑞琴老師指導(dǎo)下獨(dú)立完成的，沒有抄襲他人成果，對(duì)本文的研究作出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。 （二） 通過結(jié)合蕓薹屬多國功能基因組結(jié)果獲得該基因的全長(zhǎng)序列?？捎ɡ僦谢ㄝ?、花瓣、雄蕊和雌蕊只在雄蕊中表達(dá)，而在其他花器官組織中均不表達(dá)。開花時(shí)柱頭先伸出花朵，花瓣小且分離不重疊。(8)將 RNA 樣品保存于一 70℃ 下 75%的乙醇中。比值 在 ～ 之 間為好。 Marker。結(jié)果發(fā)現(xiàn) , ACTIN基因在所有的不育及可育植株的須根、根、莖、葉、花蕾各個(gè)部位中均有相似表達(dá)，表明以 ACTIN基因作不育基因研究的內(nèi)標(biāo)基因是可靠的。而目的基因 BFAPG僅在可育花蕾中有較高水平的表達(dá)，而在 不育花蕾中 幾乎沒有表達(dá) , 條帶用肉眼很難辨認(rèn) ，該基因?yàn)橛韵嚓P(guān)基因 （ 圖 4)。在每一個(gè)循環(huán)中，先于 94℃ 保持 30 秒鐘使模板變性，54℃ 退火 30 秒鐘 ， 72℃ 延伸 30 秒， 完成一個(gè)循環(huán)。 選取 PCR 檢測(cè)為陽性的克隆送 上海生工進(jìn)行測(cè)序，測(cè)得序列去除載體和接頭序列即獲得目的片段。加入 500μl漂洗液 RW，室溫靜置 2 min， 4℃ 120xx rpm 離心 30 sec，棄廢液。 RNA 提取過程、 cDNA 一 鏈合成均在無菌操作臺(tái)上進(jìn)行。 實(shí)驗(yàn)方法 取樣方法 植株現(xiàn)蕾開花后，分別取不育株和可育株花蕾進(jìn)行研究。由于細(xì)胞核雄性不育材料的雄蕊退化一般比較徹底、不育性穩(wěn)定、無不良性狀伴生，倍受育種工作者的重視。 這一現(xiàn)象在小麥、玉米、高梁、洋蔥 ,番茄 ,辣椒和水稻等植物中普遍存在 (Zhang 和 Croes,1983)。 6. 花粉囊專一性的脯氨酸富集蛋白 在不育中研究現(xiàn)狀。這說明線粒體的膜磷脂組分和脂肪酸配比可能受細(xì)胞質(zhì)基因影響 ,與 HLCMS 的育性可能具有一定的聯(lián)系。第一步脂肪酶水解第一或第三全酯鍵，即 α或α′酯鍵，如果第一步水解α 酯鍵，第二水解α′酯鍵，生成α和α′脂肪酸和甘油 酯，最后，β 位的脂肪酸在轉(zhuǎn)移酶的催化下β 的脂肪酸轉(zhuǎn)到α或α′位上，再在脂肪酶的作用下，脂肪酸水解下來，共生成三分子脂肪酸和一分子甘油，水解過程為： 脂肪 （甘油三酯）水解的產(chǎn)物：一分子甘油和三分子脂肪酸。 3 脂肪酶的作用 脂肪酶即三酰基甘油?；饷福呋烊坏孜?油脂水解 ， 生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯。 郭爽 等以辣椒 (Capsicum annuum L.)細(xì)胞質(zhì)雄性不育系 23A、 121A 和其相應(yīng)的近等基因恢復(fù)系 23C、 121C 為試驗(yàn)材料 ,利用抑制差減雜交 (SSH)技術(shù)成功構(gòu)建了 CMS 恢復(fù)基因誘導(dǎo)表達(dá)的消減 cDNA 文庫。另外 SSH 所需的起始 RNA 量較大 ,一般為幾微克 ,對(duì)于一些珍貴稀有的不易獲得足夠 RNA 的材料要慎重使用。(3)試驗(yàn)組的 cDNA 與過量的驅(qū)動(dòng)組 cDNA 雜交 。 Schmulling(1988)等將農(nóng)桿菌 TDNA 間的 rolC 基因與 CaMV35S 啟動(dòng)子串聯(lián)成嵌合基因轉(zhuǎn)化煙草，獲得雄性不育株。 (3)利用反義 RNA 技術(shù)獲得植物雄性不育。 5） 原生質(zhì)體融合 在有性雜交中，細(xì)胞質(zhì)基因組只是來自母本，而在體細(xì)胞雜交中，雜種卻擁有兩個(gè)親本的細(xì)胞質(zhì)基因組。 2） 種間雜交 植物雄性不育性不僅發(fā)生在種內(nèi)，而且也出現(xiàn)在種間或?qū)匍g雜種的后代。 2） 核質(zhì)互作雄性不育 這種類型的雄性不育性由不育細(xì)胞質(zhì)因子（ S）和不育細(xì)胞核基因（ fr）共同控制。 Sears 根據(jù)遺傳機(jī)制的差異，將植物雄性不育可分為細(xì)胞核雄性不育，細(xì)胞質(zhì)雄性不育和核質(zhì)互作雄性不育 3 種類型，稱之為“三型學(xué)說 ”； Edwardson(1956)把“三型學(xué)說”中的質(zhì)不育和質(zhì)沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位畢業(yè)論文 3 核互作不育并為一類，從而把植物雄性不育分為核不育型和核質(zhì)互作不育型（常簡(jiǎn)稱為細(xì)胞質(zhì)雄性不育）簡(jiǎn)稱為“二型學(xué)說”。因而利用細(xì)胞質(zhì)雄性不育系制種是生產(chǎn)一代雜種種子最經(jīng)濟(jì)，最有效的途徑之一，因此受到世界各國育種者的重視。白菜產(chǎn)量高、耐貯藏、營養(yǎng)豐富。不同等級(jí)大小花蕾中的時(shí)序表達(dá)結(jié)果顯示，各等級(jí)可育花蕾中均有同等程度的表達(dá)，而在不育花蕾中均不表達(dá)。 4 認(rèn)真撰寫論文，字?jǐn)?shù)在 10000 字以上。 三 .論文工作進(jìn)度安排 階段 論文各階段名稱 日期 1 畢業(yè)論文設(shè)計(jì) — 2 田間及實(shí)驗(yàn)室獲取數(shù)據(jù) — 3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析 — 4 整理資料，攥寫論文 — 5 論文完成 備注： 四 .應(yīng)收集的資料及主要參考文獻(xiàn)（指導(dǎo)教師指定） 說明： 此任務(wù)由指導(dǎo)教師填寫一式兩份，一份發(fā)給學(xué)生，一份發(fā)給指導(dǎo)教師留存?？捎ɡ僦谢ㄝ?、花瓣、雄蕊和雌蕊只在雄蕊中表達(dá)，而在其他花器官組織中均不表達(dá)。不但適合炒、煮、拌、腌，而且還可生食越來越受到人們的喜愛。 植物雄性不育研究簡(jiǎn)史 植物雄性不育是指植株不能產(chǎn)生正常的花藥、花粉或雄配子，而其雌性生殖系統(tǒng)發(fā)育和營養(yǎng)生長(zhǎng)完全正常的一種生物學(xué)現(xiàn)象，其廣泛存在于開花植物中。 Gabelman（ 1956）根據(jù)花粉、雄蕊的形態(tài)將雄性不育劃分為花粉型、雄蕊型和功能型 3 類； HeslopHarrison(1971)按世代交替把雄性不育劃分為孢子體不育和配子體不育 2 種類型。當(dāng)細(xì)胞核存在顯性恢復(fù)基因（ Fr）時(shí)， Fr 基因可以抑制不育胞質(zhì)的作用而產(chǎn)生雄性可育。約 74%核質(zhì)互作雄性不育來自種間或?qū)匍g雜種的后代。因而體細(xì)胞雜交為研究雙親細(xì)胞器的互作提供了新手段，這種雜種稱作細(xì)胞質(zhì)雜種（ Cybrid）?；ǚ郯l(fā)育是一個(gè)及其復(fù)雜的過程，許多基因與花粉發(fā)育有關(guān)。 (6)隨著分子水平的研究不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)細(xì) 胞質(zhì)雄性不育與線粒體基因有密切沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位畢業(yè)論文 5 關(guān)，現(xiàn)在已在玉米、矮牽牛、油菜等線粒體 DNA 上找到了與 CMS 有關(guān)的基因。(4)選擇性 PCR 擴(kuò)增與接頭相連的試驗(yàn)組 cDNA 分子 。 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位畢業(yè)論文 6 SSH 技術(shù)自 1996 年提出以來 ,在動(dòng)物研究領(lǐng)域中 ,已成功地應(yīng)用到許多分子遺傳學(xué)和基因克隆的研究中 ,如鑒別病理變化、生物體生長(zhǎng)發(fā) 育、組織分化中的基因表達(dá)變化以及其他差別表達(dá)的基因。結(jié)合高密度點(diǎn)陣膜雜交差 異篩選 ,獲得了 282 個(gè)陽性克隆。 脂肪酶基本組成單位僅為 氨基酸 ，通常只有一條多肽鏈。 分別用 HPLC 和 GC 分析了紅蓮型細(xì)胞質(zhì)雄性不育水稻同核異質(zhì)系 YTA 和 YTB 線粒體總膜、內(nèi)膜以及外膜磷脂類型和脂肪酸的各組分 ,并用面積歸一化法定量分析了各種膜磷脂組分和脂肪酸的含量配比。 劉齊元（ 20xx）煙草游離脯氨酸含量與雄性不育性的關(guān)系結(jié)果表明 ,花蕾中不育系的脯氨酸含量在小花蕾階段與其保持系非常接近 ,但從中花蕾開始 ,保持系花蕾中的脯氨酸含量急劇上升 ,而不育系花蕾中的脯氨酸含量則基本保持穩(wěn)定 ,因而 ,不育系花蕾中的脯氨酸含量在大花蕾時(shí)期明顯低于其保持系 。 一般認(rèn)為 , 花藥中游離氨基酸含量 , 尤其是游離脯氨酸含量與花粉育性 有密切關(guān)系。 王強(qiáng)等（ 20xx）采用化學(xué)殺雄劑以及增加脯氨酸的去雄劑對(duì)棉花花藥氨基酸的影響，得出化學(xué)殺雄劑引起的氨基酸代謝失調(diào)可能是造成雄性不育的主要原因之一。 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位畢業(yè)論文 9 理想雄性不育系的不育株率應(yīng)為 100%，經(jīng)濟(jì)性狀具有較高的配合力。 我們按照花藥在可育 、 不育花蕾中的發(fā)育變化情況 ， 初步 將花蕾 分為 6 個(gè)等級(jí)，即 1 級(jí)（花蕾長(zhǎng)度＜ mm），穩(wěn)定發(fā)育期； 2 級(jí)（花蕾長(zhǎng)度： ～ 2mm），不育初期； 3 級(jí)（花蕾長(zhǎng)度 : 2～ ）， 4級(jí)（花蕾長(zhǎng)度 : ～ 3 mm）， 5 級(jí)（花蕾長(zhǎng)度 : 3～ ）， 6 級(jí)（花蕾長(zhǎng)度＞ mm） ， 分別選取開花期一致、其它性狀相同的不育和可育材料的未開放花蕾按上述標(biāo)準(zhǔn)分別分為6 個(gè)等級(jí)。 2 總 RNA 提取及質(zhì)量檢測(cè)分析 使 用 RNA simple Total RNA Kit（ TIANGEN 公司，離心柱型）進(jìn)行總 RNA 提取 ，參照說明書，具體步驟如下： 取 樣品，液氮研磨后迅速加入 1ml裂解液 RZ，漩渦 1min，室溫放置 5min。將吸附柱 CR3 放入 2 ml管中，加入 50μl RNasefree ddH2O，室溫放置 2 min。 RTPCR 以可育株與不育株花蕾為材料，重復(fù)三次，每重復(fù)為 10 棵植株的混合花蕾。重復(fù)這樣的循環(huán) 27 次，使擴(kuò)增的 DNA 片段大量累積。 F S ACTIN 412bp BFAPG 376bp 1 G T AC CC G CC T A TCG CA G G TT G CG C CG C A TC AA G CC CG A CG AC CT T AA AA C 5 1 TG G CG TTTG T TTCG CA TCA G G TG G TTCA G G AA TTG AC CA T CT T AC A TCC A 1 0 1 G AA CA CTG G G AG TT TTG TCC AC AG G CG AC C AA A T A G G AG A TTTC AA AA AA 1 5 1 T A TTTG AA G A AA T T A AA G AA TG CG AC G AA A A A T AA G AA A G AA A T G AA AA A 2 0 1 AA T AA T TTCA AA CG C AG TG T TTCT T A TTT C TG AA G G AA A T AA CG A T A TT G 2 5 1 G A T AC TTC G T G AC T CC CG CT CG TC T AC G A T T A CG A TCC A T AG A T AC A T A C 3 0 1 AC AA G TG AC A TG G T TTTTTG G AC AA AA G CA TT CC T AC AA G A TT T A T A T G A 3 5 1 TCTT G G AG C G AG AA AA TTC G CG G T G A TG G G A G TG A TTCC G G T AG G A TG CT 4 0 1 TG CC CTTC CA TCG C TT CC T A TTTG G TG G AG T A TTCG CA T G G TG T AA CTT C 4 5 1 A TG A TG AA T A G A A TT TCG G A AG AC TT CA AC AC A AA A TT AC AG AA A G CTC T 5 0 1 T A TTG G T T AC G A AG T AG AA A AA A G TTTT AA AG G TG CA AA G TTTG TTT A CG 5 5 1 TCG AC A TG 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位畢業(yè)論文 14 圖 4 BFAPG 基因在可育、不育花蕾中的表達(dá) 。而目的基因 BFAPG僅在可育花蕾中有較高水平的 表達(dá)，而在可育植株的其它部位及 不育花蕾中 均 沒有表達(dá) , 肉眼看不出有條帶產(chǎn)生 （圖 6） ，表明該基因?yàn)榭捎ɡ偬禺惐磉_(dá)基因 。 16 分別為可育植株的 16 級(jí) 花蕾； 712 分別為不育植株 的 16 級(jí) 花蕾 BFAPG 基因 在花器官的表達(dá)分析 分別取 可育 植株 的花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊 為材料進(jìn)行研究 , 采用 RTPCR方法調(diào)查了 BFAPG基因的表達(dá)差異變化 ，重復(fù) 3次 。 要想獲得理想的 RNA 產(chǎn)量 和純度，除防 止 RNase 污染外，還應(yīng)注意以下幾點(diǎn) :(l)取下的樣品應(yīng)立即處理或冷凍 。 RNA 通常用分光光度計(jì)定量，測(cè)量在 260nm 處的吸收值 （ A260） 。其柱頭頂端電鏡觀察豁絨層完好，可正常授粉。說明此基因跟雄蕊的生長(zhǎng) 發(fā)育 有關(guān)。 TBLASTX 比對(duì)結(jié)果顯示該基因?qū)儆?花粉囊專一性的脯氨酸富集蛋白 基因 也可能屬于 脂肪酶 基因 。 完成人簽名： 指導(dǎo)教師簽名： 20xx 年 6 月 2 日 20xx 年 6 月 15 日 文 獻(xiàn) 綜 述 題 目： 大白菜核基因雄性不育抑制差減文庫構(gòu)建 抑制性差減雜交 (SSH)技術(shù)及其在大白菜轉(zhuǎn)育上的應(yīng)用 摘要 : 白菜原產(chǎn)于我國北方，俗稱大白菜。首先， SSH 技術(shù)廣泛應(yīng)用在分離植物發(fā)育過程中不同發(fā)育階段和不同組織器官中的組織特異性表達(dá)的基因，為揭示植物生長(zhǎng)發(fā)育過程的分子