【文章內(nèi)容簡介】 蕊中 , 相應于小抱子單核初期時 , 可育株稍高于不育株 , 受精后迅速趨于一致 , 但整個變化幅度不大。 這一現(xiàn)象在小麥、玉米、高梁、洋蔥 ,番茄 ,辣椒和水稻等植物中普遍存在 (Zhang 和 Croes,1983)。 王強等（ 20xx）采用化學殺雄劑以及增加脯氨酸的去雄劑對棉花花藥氨基酸的影響，得出化學殺雄劑引起的氨基酸代謝失調可能是造成雄性不育的主要原因之一。關其原因可能是植株受到脅迫后 , 光合作用減弱 ( 從葉綠 素含量降低可以說明 ) , 棉葉合成的 Pro 減少 , 并導致了輸送到花藥的 Pro 降低。棉花植株遭受化學殺雄劑脅迫時 ,表現(xiàn)出來的生理反應還有礦質營養(yǎng)元素硼、錳、硫、銅、鋅、鎂、鈣、鐵等的吸收、運輸受到影響。 大白菜為兩性花異花傳粉蔬菜作物，雜種優(yōu)勢十分顯著。由于其花器官小，單花結籽少，而單位面積的播種量又較大，常規(guī)的雜交制種必然存在去雄費工、費力、成本高等缺點。雄性不育系的利用是配制大白菜雜交種經(jīng)濟、可靠的制種手段 (孫日飛， 20xx)。已經(jīng)獲得的大白菜雄性不育材料，可以分成細胞核雄性 不育（ GMS）和細胞質雄性不育（ CMS）兩種類型。由于細胞核雄性不育材料的雄蕊退化一般比較徹底、不育性穩(wěn)定、無不良性狀伴生，倍受育種工作者的重視。 沈陽農(nóng)業(yè)大學學士學位畢業(yè)論文 9 理想雄性不育系的不育株率應為 100%，經(jīng)濟性狀具有較高的配合力。 100%不育株率的雄性不育材料最早是由本課題組于 1991 年在大白菜雄性不育“兩用系”輪配試驗中育成的，由于用傳統(tǒng)的單基因隱性或顯性遺傳無法解釋這種遺傳現(xiàn)象，從而提出了“大白菜核基因雄性不育復等位基因遺傳假說”（ Feng Hui et al., 1995），并為后來的實驗所證實（ Feng Hui et al., 1996）。 目前本課題組已建立了一套該材料的應用技術體系，并實現(xiàn)了品種間和亞種間核不育復等位基因的交流，育成了多個新的具有 100%不育株率的雄性不育系 ,但對其產(chǎn)生雄性不育的分子基理還不清楚。本課題組通過抑制差減雜交技術及 cDNAAFLP 方法已找到了一系列育性相關基因，但對于單個基因的功能及作用部位尚不清楚。本研究即對大白菜育性相關 花粉囊專一性的脯氨酸富集蛋白 基因 BFAPG 的功能及時序表達作了相應研究，為探索復等位基因遺傳的大白菜核雄性不育的機理奠定了基礎。 1 材料和方法 1 材料和方法 實 驗材料 本研究所用材料為本課題組轉育的大白菜雄性不 育甲型兩 用系 “AB01 ”，不育與可育材料除育性外背景相同，是研究差異基因分離的理想材料。當甲型兩用系植株現(xiàn)蕾開花后，分別取不育株和可育株花蕾進行研究。 實驗方法 取樣方法 植株現(xiàn)蕾開花后，分別取不育株和可育株花蕾進行研究。 我們按照花藥在可育 、 不育花蕾中的發(fā)育變化情況 ， 初步 將花蕾 分為 6 個等級，即 1 級（花蕾長度＜ mm），穩(wěn)定發(fā)育期； 2 級（花蕾長度： ～ 2mm），不育初期； 3 級（花蕾長度 : 2～ ）， 4級（花蕾長度 : ～ 3 mm）， 5 級（花蕾長度 : 3～ ）， 6 級（花蕾長度＞ mm） ， 分別選取開花期一致、其它性狀相同的不育和可育材料的未開放花蕾按上述標準分別分為6 個等級。 另外對 56 級的大花蕾有分別取萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊四份材料。裝入 管中，液氮速凍后， 85℃冰箱保存?zhèn)溆?裝入 管中，液氮速凍后， 85℃冰箱保存?zhèn)溆谩? RNA 提取 1 用具的處理、溶液配制及無 RNase 操作 ml PE 管 、 ml PCR 管、各種規(guī)格的槍頭 用 %的 DEPC 溶液浸泡處理過夜，121℃ 高壓滅菌 30 min。 用 % DEPC 水配 制 75 %乙 醇、 5 mol L1 NaAc，高壓滅菌。新的無水乙醇、氯仿、異丙醇。 RNA 提取過程、 cDNA 一 鏈合成均在無菌操作臺上進行。 2 總 RNA 提取及質量檢測分析 使 用 RNA simple Total RNA Kit（ TIANGEN 公司，離心柱型）進行總 RNA 提取 ，參照說明書，具體步驟如下： 取 樣品，液氮研磨后迅速加入 1ml裂解液 RZ，漩渦 1min，室溫放置 5min。沈陽農(nóng)業(yè)大學學士學位畢業(yè)論文 10 加入 200μl氯仿，劇烈震蕩 15sec，室溫放置 3 min。 4℃ 120xx rpm 離心 10 min，上層水相約 500μl轉到新管。緩慢加入 倍無水乙醇，混勻后轉入吸附柱 CR3。 4℃ 120xx rpm離心 30 sec，棄廢液。向吸附柱 CR3 加入 500μl去蛋白液 RD， 4℃ 120xx rpm 離心30 sec，棄廢液。加入 700μl漂洗液 RW，室溫靜置 2 min， 4℃ 120xx rpm 離心 30 sec，棄廢液。加入 500μl漂洗液 RW，室溫靜置 2 min， 4℃ 120xx rpm 離心 30 sec，棄廢液。將吸附柱 CR3 放入 2 ml管中，加入 50μl RNasefree ddH2O，室溫放置 2 min。 4℃ 120xx rpm離心 2 min。重復 1011 操作，合并兩次得到的溶液。 取 RNA 樣品，加 1μl 6的 loading buffer 后于 %瓊脂糖膠上電泳，電壓 6Vcm1，電泳 1520 min 后，凝膠成像儀照相分析。 目的片段獲得方法 將提取的 RNA采用 MicroFast Track 試劑盒 (Invitrogen)提供的試劑進行 mRNA的純化，并按試劑盒推薦方法進行操作。 使用 PCR Select cDNA Subtraction Kit(Clontech)提 供的試劑進行抑制差減雜交，并根據(jù)試劑盒說明進行操作，分別將可育株為測試組及不育株為測試組的正向和 反向 SSH 的第二 次 PCR 產(chǎn) 物連接在載體 pGEMTeasy（ Promega） 上，并轉化大腸桿 菌 JM109感 受態(tài)細胞，培養(yǎng)在含有 IPTG 和 XGal 的 LB氨 芐培養(yǎng)基上，挑選白色陽性克隆 于 96 微孔 板中，分別構成正向和反向消減 cDNA 文 庫，挑取白色克隆 用通用測序引物 (M 13/pUC Sequencing primer,M13/pUC Reverse Sequencing primer)進行 PCR 檢測。 選取 PCR 檢測為陽性的克隆送 上海生工進行測序，測得序列去除載體和接頭序列即獲得目的片段。 RTPCR 以可育株與不育株花蕾為材料，重復三次，每重復為 10 棵植株的混合花蕾。分別提取 RNA（方法同 ） , 并采用 MMLV (PROMEGER)合成第一鏈 cDNA (參照說明書進行 )。 第一鏈 cDNA 合成反應 見表 1： 表 1 第一鏈 cDNA 合成反應體系 組分 Components 反應體系 Reaction system Template RNA μg 51st Strand Synthesis Buffer μl dNTP Mixture μl RNase Inhibitor μl Oligo(dT)18 μl Reverse Transcriptase（ MMLV）（ 200 U/μl） μl RNaseFree ddH2O 定容 至 μl 沈陽農(nóng)業(yè)大學學士學位畢業(yè)論文 11 表 2 RTPCR 中防御相關基因的引物及退火溫度 Table2The primers and annealing temperature for defense related gene expression experiments 按照上述體系輕柔攪拌混勻各組分，室溫放置 10 分鐘后，移至 42℃ 恒溫水浴槽內(nèi)，反應 1 小時，反應結束后置于冰中冷卻 2 分鐘 線性擴增期確定 , 以不同濃度可育株 cDNA 為模板 , 檢測內(nèi)參基因 ACTIN 在不同循環(huán)數(shù)下產(chǎn)物量的差異 , 找出線性擴增期循環(huán)數(shù)作為半定量過程中的參照循環(huán)數(shù)。 RTPCR檢測 , 根據(jù)目的基因片段序列利用 PRIMER5 及 DNAMAN設計目 的基因引物，提交 INVITROGEN 公司合成引物序列。 以不育花蕾和可育花蕾的第一鏈 cDNA 為模板 ,在線性擴增期進行半定量 PCR, 相關參數(shù)見表 2。 PCR 反應體系： 組分 Components 反應體系 Reaction system Template cDNA 5μl 10Buffer 3μl dNTP Mixture 引物 上游 1μl 引物 下 游 1μl UμL1 Taq 酶 RNaseFree ddH2O 定容 至 μl PCR 反應 程序： PCR 反應程序： 基因 引物 序列 (5’ → 3’) 產(chǎn) 物長度 /bp 退火溫度 /℃ ACTIN F ATCTACGAGGGTTATGCT 412 54 R CCACTGAGGACGATGTTT BFAPG F CATCAAGCCCGACGACCT 412 58 R TGCGAATACTCCACCAAAT 沈陽農(nóng)業(yè)大學學士學位畢業(yè)論文 12 將 PCR 反應所需的成分配置完后，在 PCR 儀上 94℃ 預加熱 30 秒，使模板 DNA 充分變性，然后進入擴增循環(huán)。在每一個循環(huán)中，先于 94℃ 保持 30 秒鐘使模板變性，54℃ 退火 30 秒鐘 ， 72℃ 延伸 30 秒， 完成一個循環(huán)。重復這樣的循環(huán) 27 次，使擴增的 DNA 片段大量累積。最后，在 72℃ 保持 37min ，使產(chǎn)物延伸完整， 4℃ 保存。 94℃ 3min 94℃ 30s 54℃ 30S 30 個循環(huán) 72℃ 30s 72℃ 5min 全長序列的獲得 利用 本課題組參與的“ 多國蕓薹屬植物基因組計劃項目”中大白菜 Chiifu的利用 Chiifu BAC文庫與基因組測序結果信息資源，以 片段 序列試圖調取全長 cDNA序列 序列相似性搜索 利用 National Center for Biotechnology Information (NCBI)中的 BLAST 工具與 dbEST數(shù)據(jù)庫，進行特異表達基因同源性比較和功能分析，根據(jù)查詢序列（ Query）與比對序列（ Sbjct）共同跨越部分長度（ Alignment scores）、 Evalue 及同源相似性（ Identities）推測該特異表達基因的可能生物學功能。 2結果與分析 RNA 提取 我們將花蕾按照花藥在可育不育花蕾中的發(fā)育變化情況初步分為 6 個等級，即 1 級（花蕾長度＜ mm），穩(wěn)定發(fā)育期； 2 級（花蕾長度： ～ 2mm），不育初期； 3 級（花蕾長度 : 2～ ）， 4 級（花蕾長度 : ～ 3 mm）， 5 級（花蕾長度 : 3～ ）， 6 級（花蕾長度＞ mm） ， 分別選取開花期一致、其它性狀相同的不育和可育材料的未開放花蕾按上述標準分別 分為 6個等級。并分別提取 RNA， RNA提取采用 TIANGEN公司 RNA simple Total RNA Kit 進行，所提 RNA 質量合格，表現(xiàn)為 28S 與 18S 亮度接近 2： 1， OD260/OD280在 之間。（如圖 1） F1 F6 S1 S6 沈陽農(nóng)業(yè)大學學士學位畢業(yè)論文 13 圖 1 甲型兩用系 ‘AB01’ 不同等級花蕾 RNA電泳圖 F1F6 可育花蕾 6個級別； S1S6 不育花蕾 6個級別 肉桂酸轉移酶基因 BFAPG 片段的獲得 按照 Clontech 公司的 PCRSelectTM cDNA Subtraction Kit 說明書，經(jīng) 抑制差減雜交及M13 通用引物 PCR 驗證獲得一片段大小約 600bp 的 條帶 （圖 2） ， 將該克隆送往上海生工進行測序，去除載體和接頭序列后得到該片段的序列（圖 3） ： 圖 2 抑制差減文庫獲得 BFSKS 克隆的 PCR 檢測結果 圖 3 BFSKS 基因片段的測序結果 BFAPG 差異表達片段 RTPCR 驗證 以 不育 花蕾 與可育花蕾 （均為不同等級大小的花蕾等量混合） 為材料 進行研究 , 采用 RTPCR方法調查了 BFAPG基因的表達差異變化。結果發(fā)現(xiàn) ,內(nèi)標基因在所合成的不育及可育花蕾中均有相似表達，表明以 ACTIN基因作不育基因研究的內(nèi)標基因是可靠的。而目的基因 BFAPG僅在可育花蕾中有較高水平的表達，而在 不育花蕾中 幾乎沒有表達 , 條帶用肉眼很難辨認 ，該基因為育性相關基因 （ 圖 4)。 F S ACTIN 412bp BFAPG 376bp 1 G T AC CC G CC T A TCG CA G G TT G CG C CG C A TC AA G CC CG A CG AC CT T AA AA C 5 1 TG G CG TTTG T TTCG CA TCA G G TG G TTCA G G AA TTG AC CA T CT