【正文】 核存在顯性恢復(fù)基因（ Fr）時， Fr 基因可以抑制不育胞質(zhì)的作用而產(chǎn)生雄性可育。根據(jù)不育基因與對應(yīng)的可育基因之間的顯隱關(guān)系，又可分為隱性核不育和顯性核不育兩類。 Gabelman（ 1956）根據(jù)花粉、雄蕊的形態(tài)將雄性不育劃分為花粉型、雄蕊型和功能型 3 類； HeslopHarrison(1971)按世代交替把雄性不育劃分為孢子體不育和配子體不育 2 種類型。植物不能產(chǎn)生功能花藥、花粉或雄配子的現(xiàn)象稱雄性不育 [3]。 植物雄性不育研究簡史 植物雄性不育是指植株不能產(chǎn)生正常的花藥、花粉或雄配子，而其雌性生殖系統(tǒng)發(fā)育和營養(yǎng)生長完全正常的一種生物學(xué)現(xiàn)象，其廣泛存在于開花植物中。白菜一代雜種的種子生產(chǎn)常用方法是利用自交不親和系和雄性不育系。不但適合炒、煮、拌、腌，而且還可生食越來越受到人們的喜愛。 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位畢業(yè)論文 1 Abstract 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位畢業(yè)論文 2 前言 白菜（ Brassica campestris L. Makino）屬十字花科蕓薹屬蕓薹種白菜亞種，起源于中國，栽培歷史悠久，資源豐富，類型多樣，是我國重要蔬菜之一，在各類蔬 菜中栽培面積最大?？捎ɡ僦谢ㄝ?、花瓣、雄蕊和雌蕊只在雄蕊中表達(dá)，而在其他花器官組織中均不表達(dá)。 本部分試驗(yàn) 以 大白菜核基因雄性不育甲型兩用系不育、可育花蕾為材料 ， 構(gòu)建正反抑制差減 cDNA 文庫，篩選出的大白菜育性相關(guān)多銅氧化酶基因 ,并通過序列測定及生物信息學(xué)分析鑒定這個基因的功能，并利用 RTPCR 技術(shù)分析基因時空表達(dá)模式。 三 .論文工作進(jìn)度安排 階段 論文各階段名稱 日期 1 畢業(yè)論文設(shè)計 — 2 田間及實(shí)驗(yàn)室獲取數(shù)據(jù) — 3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析 — 4 整理資料，攥寫論文 — 5 論文完成 備注： 四 .應(yīng)收集的資料及主要參考文獻(xiàn)（指導(dǎo)教師指定） 說明： 此任務(wù)由指導(dǎo)教師填寫一式兩份，一份發(fā)給學(xué)生，一份發(fā)給指導(dǎo)教師留存。 畢 業(yè) 論 文 題 目： 大白菜育性相關(guān) 花粉囊專一性的脯氨酸富集蛋白基因BFAPG的 獲得及表達(dá) 分析 畢業(yè)論文 任務(wù)書 論文題目 下發(fā)任務(wù)日期 學(xué)生姓名 指導(dǎo)教師 一 . 論文主要內(nèi)容 本研究以本課題組轉(zhuǎn)育的大白菜雄性不育兩用系 “AB01”為材料，采用抑制差減雜交（ SSH）技術(shù) 二 .論文的基本要求 ： 要求盡量收集第一手資料，資料要真實(shí)、可靠、有代表性。 4 認(rèn)真撰寫論文，字?jǐn)?shù)在 10000 字以上。本課題組率先育成 100%不育株率的雄性不育材料，但是，對其遺傳規(guī)律的認(rèn)識還停留在形態(tài)和細(xì)胞水平，產(chǎn)生雄性不育的分子基理還不清楚。不同等級大小花蕾中的時序表達(dá)結(jié)果顯示，各等級可育花蕾中均有同等程度的表達(dá)，而在不育花蕾中均不表達(dá)。并且其基因可能與雄蕊的生長于發(fā)育有關(guān)， BFAPG 基因的分離與表達(dá)分析可為進(jìn)一步探討 氨基酸代謝 在大白菜育性調(diào)控中的可能作用提供幫助。白菜產(chǎn)量高、耐貯藏、營養(yǎng)豐富。自“六五”開展全國攻關(guān)以來，在育種技術(shù)手段和方法上獲得了較大的提高，相繼育成了一大批優(yōu)質(zhì)、抗病，豐產(chǎn)的一代雜種并 在生產(chǎn)上推廣利用。因而利用細(xì)胞質(zhì)雄性不育系制種是生產(chǎn)一代雜種種子最經(jīng)濟(jì)，最有效的途徑之一，因此受到世界各國育種者的重視。 植物雄性不育的類型及遺傳機(jī)制 植物雄性不育有許多不同的表現(xiàn)，常見的有：（ 1）雄性器官萎縮，畸形或消失；（ 2）不能形成正常的小孢子發(fā)生組織；（ 3）小孢子發(fā)育異常，形 成不完善的、不能存活的畸形或敗育的花粉；（ 4）花粉不能成熟或無萌發(fā)能力；（ 5）能形成有活力的花粉，但花藥不開裂。 Sears 根據(jù)遺傳機(jī)制的差異，將植物雄性不育可分為細(xì)胞核雄性不育，細(xì)胞質(zhì)雄性不育和核質(zhì)互作雄性不育 3 種類型，稱之為“三型學(xué)說 ”； Edwardson(1956)把“三型學(xué)說”中的質(zhì)不育和質(zhì)沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位畢業(yè)論文 3 核互作不育并為一類，從而把植物雄性不育分為核不育型和核質(zhì)互作不育型（常簡稱為細(xì)胞質(zhì)雄性不育）簡稱為“二型學(xué)說”。 1） 細(xì)胞核雄性不育 細(xì)胞核雄性不育由核基因控制，其作用不受細(xì)胞質(zhì)類型的影響，因此，這種類型的雄性不育性的遺 傳和表達(dá)完全遵循孟德爾遺傳規(guī)律。 2） 核質(zhì)互作雄性不育 這種類型的雄性不育性由不育細(xì)胞質(zhì)因子（ S）和不育細(xì)胞核基因（ fr）共同控制。屬于這種類型的不育系，在理論上只有保持系，找不到恢復(fù)系。 2） 種間雜交 植物雄性不育性不僅發(fā)生在種內(nèi)，而且也出現(xiàn)在種間或?qū)匍g雜種的后代。在無法找到合適的沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位畢業(yè)論文 4 遺傳性雄性不育時，化學(xué)殺雄劑的研制和利用在一代雜種的種子生產(chǎn)中發(fā)揮了重要作用。 5） 原生質(zhì)體融合 在有性雜交中，細(xì)胞質(zhì)基因組只是來自母本，而在體細(xì)胞雜交中，雜種卻擁有兩個親本的細(xì)胞質(zhì)基因組。已在蕓薹屬種內(nèi)、種間、屬間及族間通過體細(xì)胞雜交實(shí)現(xiàn)了胞質(zhì)基因組的轉(zhuǎn)移，改良或創(chuàng)造了細(xì)胞質(zhì)雄性不育系。 (3)利用反義 RNA 技術(shù)獲得植物雄性不育。是在孢母細(xì)胞減數(shù)分裂完成后作為小孢子的臨 時膜，以分隔產(chǎn)生的四分孢子，防止它們之間相互粘連和融合。 Schmulling(1988)等將農(nóng)桿菌 TDNA 間的 rolC 基因與 CaMV35S 啟動子串聯(lián)成嵌合基因轉(zhuǎn)化煙草，獲得雄性不育株。 SSH 的基本原理 抑制差減雜交技術(shù)運(yùn)用了雜交二級動力學(xué)原理 ,即高豐度的單鏈 cDNA 在退火時產(chǎn)生同源雜交的速度快于低豐度的單鏈 cDNA,在試驗(yàn)組 (tester)和驅(qū)動組 (driver)的 cDNA變性后再復(fù)性的過程中 ,原來在豐度上有差別的單鏈 cDNA 達(dá)到均一化。(3)試驗(yàn)組的 cDNA 與過量的驅(qū)動組 cDNA 雜交 。 抑制差減雜交 (SSH)技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)：抑制差減雜交 ( suppression subtractive hybridization, SSH)是基于抑制 PCR 和差減雜交技術(shù)建立的簡單有效的方法 [1],通過一次差減雜交可使低豐度的序列 (mRNA)得以高于 1000 倍的富集 ,有效的選擇性擴(kuò)增目標(biāo)序列 ,同時抑制 非目標(biāo)序列的擴(kuò)增 ,因此在分離基因特別是分離低豐度差異表達(dá)基因方面具有更廣闊的應(yīng)用前景。另外 SSH 所需的起始 RNA 量較大 ,一般為幾微克 ,對于一些珍貴稀有的不易獲得足夠 RNA 的材料要慎重使用。文庫質(zhì)量檢測表明 ,差減雜交效率較高 ,質(zhì)量較好。 郭爽 等以辣椒 (Capsicum annuum L.)細(xì)胞質(zhì)雄性不育系 23A、 121A 和其相應(yīng)的近等基因恢復(fù)系 23C、 121C 為試驗(yàn)材料 ,利用抑制差減雜交 (SSH)技術(shù)成功構(gòu)建了 CMS 恢復(fù)基因誘導(dǎo)表達(dá)的消減 cDNA 文庫。120 個 EST 片段找到了對應(yīng)的同源序列 ,包括 103 個已知功能基因和 17 個未知功能基因。 3 脂肪酶的作用 脂肪酶即三酰基甘油?；饷福呋烊坏孜?油脂水解 ， 生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯。脂肪酶不同活性的發(fā)揮依賴于反應(yīng)體系的特點(diǎn)，如在油水界面促進(jìn)酯水解，而在有機(jī)相中可以酶促合成和酯交換。第一步脂肪酶水解第一或第三全酯鍵，即 α或α′酯鍵，如果第一步水解α 酯鍵，第二水解α′酯鍵，生成α和α′脂肪酸和甘油 酯，最后，β 位的脂肪酸在轉(zhuǎn)移酶的催化下β 的脂肪酸轉(zhuǎn)到α或α′位上，再在脂肪酶的作用下，脂肪酸水解下來，共生成三分子脂肪酸和一分子甘油，水解過程為： 脂肪 （甘油三酯）水解的產(chǎn)物：一分子甘油和三分子脂肪酸?？偰ず蛢?nèi)膜中 PI 含量差異顯著 ,均為 YTA 中的含量高于 YTB,而 PA 含量均差異不明顯 。這說明線粒體的膜磷脂組分和脂肪酸配比可能受細(xì)胞質(zhì)基因影響 ,與 HLCMS 的育性可能具有一定的聯(lián)系。葉片中游離脯氨酸含量與煙草雄性不育性沒有直接關(guān)系。 6. 花粉囊專一性的脯氨酸富集蛋白 在不育中研究現(xiàn)狀。（ 2） 在小孢子單核初期 , 可育花藥內(nèi)游離脯氨酸的含量顯著高于不育花藥 , 是不育花藥的 7 倍 , 比減數(shù)分裂期增加 20 倍 , 高達(dá)其干重的 %, 占其游離總氨基酸的 50%。 這一現(xiàn)象在小麥、玉米、高梁、洋蔥 ,番茄 ,辣椒和水稻等植物中普遍存在 (Zhang 和 Croes,1983)。 大白菜為兩性花異花傳粉蔬菜作物，雜種優(yōu)勢十分顯著。由于細(xì)胞核雄性不育材料的雄蕊退化一般比較徹底、不育性穩(wěn)定、無不良性狀伴生，倍受育種工作者的重視。本課題組通過抑制差減雜交技術(shù)及 cDNAAFLP 方法已找到了一系列育性相關(guān)基因，但對于單個基因的功能及作用部位尚不清楚。 實(shí)驗(yàn)方法 取樣方法 植株現(xiàn)蕾開花后，分別取不育株和可育株花蕾進(jìn)行研究。 RNA 提取 1 用具的處理、溶液配制及無 RNase 操作 ml PE 管 、 ml PCR 管、各種規(guī)格的槍頭 用 %的 DEPC 溶液浸泡處理過夜，121℃ 高壓滅菌 30 min。 RNA 提取過程、 cDNA 一 鏈合成均在無菌操作臺上進(jìn)行。緩慢加入 倍無水乙醇，混勻后轉(zhuǎn)入吸附柱 CR3。加入 500μl漂洗液 RW，室溫靜置 2 min， 4℃ 120xx rpm 離心 30 sec，棄廢液。 取 RNA 樣品，加 1μl 6的 loading buffer 后于 %瓊脂糖膠上電泳，電壓 6V 選取 PCR 檢測為陽性的克隆送 上海生工進(jìn)行測序，測得序列去除載體和接頭序列即獲得目的片段。 RTPCR檢測 , 根據(jù)目的基因片段序列利用 PRIMER5 及 DNAMAN設(shè)計目 的基因引物，提交 INVITROGEN 公司合成引物序列。在每一個循環(huán)中，先于 94℃ 保持 30 秒鐘使模板變性，54℃ 退火 30 秒鐘 ， 72℃ 延伸 30 秒， 完成一個循環(huán)。 2結(jié)果與分析 RNA 提取 我們將花蕾按照花藥在可育不育花蕾中的發(fā)育變化情況初步分為 6 個等級，即 1 級（花蕾長度＜ mm），穩(wěn)定發(fā)育期； 2 級（花蕾長度： ～ 2mm），不育初期； 3 級（花蕾長度 : 2～ ）， 4 級（花蕾長度 : ～ 3 mm）， 5 級（花蕾長度 : 3～ ）， 6 級（花蕾長度＞ mm） ， 分別選取開花期一致、其它性狀相同的不育和可育材料的未開放花蕾按上述標(biāo)準(zhǔn)分別 分為 6個等級。而目的基因 BFAPG僅在可育花蕾中有較高水平的表達(dá)，而在 不育花蕾中 幾乎沒有表達(dá) , 條帶用肉眼很難辨認(rèn) ，該基因?yàn)橛韵嚓P(guān)基因 （ 圖 4)。 與擬南芥 胞外脂肪酶 EXL6 ()、 EXL5 ()、 EXL4 ()、 EXL3（ ） 及 EXL2（ ） mRNA分別有 95%、 96%、 91%、 67%及 68%的同源性； 與蕓薹屬幾種作物的花粉專一性脯氨酸富集蛋白 有 66%： 【 與 白菜 （ ） 、芥菜 （ ）、 甘藍(lán) （ ） 】 與毛果楊肉桂酰輔酶 A莽草酸 /N肉桂酸轉(zhuǎn)移酶蛋白 HCQL5 mRNA（ ）有 79%的同源性； 與玉米花藥專一性的脯氨酸富集蛋 白（ ）有 72%的同源性。結(jié)果發(fā)現(xiàn) , ACTIN基因在所有的不育及可育植株的須根、根、莖、葉、花蕾各個部位中均有相似表達(dá)，表明以 ACTIN基因作不育基因研究的內(nèi)標(biāo)基因是可靠的。 9 分別為可育植株的須根、根、莖、葉、花蕾； 10 分別為不育植株的須根、根、莖、葉、花蕾。 Marker。 M:Marker。比值 在 ～ 之 間為好。(4)酚 /氯仿抽提時將水相和有機(jī)相之間的變性蛋白去除干凈 。(8)將 RNA 樣品保存于一 70℃ 下 75%的乙醇中。 本部分試驗(yàn)在 RNA 分 離時使用了 TIANGEN 公司的 離心柱型 RNA 提取 試劑盒，步驟少、省時間、產(chǎn)量高，提取 的 RNA 質(zhì)量好。開花時柱頭先伸出花朵，花瓣小且分離不重疊。 綜上所述此基因是脂肪酸脫飽和酶基因產(chǎn)生的不育性狀還是與脯氨酸富集蛋白基因及其遺傳機(jī)理還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證?？捎ɡ僦谢ㄝ唷⒒ò?、雄蕊和雌蕊只在雄蕊中表達(dá)，而在其他花器官組織中均不表達(dá)。因此 ,花蕾中游離脯氨酸含量與煙草雄性不育性有密切的關(guān)系 ,不育系花蕾中脯氨酸含量低是雄性不育性導(dǎo)致的結(jié)果 。 （二） 通過結(jié)合蕓薹屬多國功能基因組結(jié)果獲得該基因的全長序列。不同等級大小花蕾中的時序表達(dá)結(jié)果顯示，各等級可育花蕾中均有同等程度的表達(dá)，而在不育花蕾中均不表達(dá)。 承諾內(nèi)容： 本畢業(yè)論文是本人在導(dǎo)師冀瑞琴老師指導(dǎo)下獨(dú)立完成的，沒有抄襲他人成果，對本文的研究作出重要貢獻(xiàn)的個人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。 白菜是人們生活中不可缺少的一種重要 蔬菜 ，味道鮮美可口，營養(yǎng)豐富，素有 “ 菜中之王 ” 的美稱，為廣大群眾所喜愛 [1]。本文通過 詳細(xì)分析該技術(shù)在植物差異表達(dá)基因分離中的應(yīng)用發(fā)現(xiàn)： SSH 技術(shù)主要用于分離組織特異性表達(dá)和誘導(dǎo)型表達(dá)的基因