【正文】 專(zhuān)業(yè) 園藝 指導(dǎo)教師姓名 冀瑞琴 職稱(chēng) 副教授 本年度指導(dǎo)畢業(yè)生人數(shù) 4 論文（設(shè)計(jì)）題目 指 導(dǎo) 過(guò) 程 時(shí)間 地點(diǎn) 指導(dǎo)內(nèi)容 主樓 334 蔬菜實(shí)習(xí)基地 主樓 327 實(shí)驗(yàn)室 主樓 327 實(shí)驗(yàn)室 主樓 327 實(shí)驗(yàn)室 主樓 334 主樓 334 論文的撰寫(xiě)及課題研究的內(nèi)容 花粉的采集，實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的前期準(zhǔn)備，搜集資料 在實(shí)驗(yàn)中的各個(gè)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)和步驟的掌握，儀器的使用，方法的了解 數(shù)據(jù)的整理，文獻(xiàn)和綜述的整理 論文 的整體規(guī)劃和寫(xiě)作 論文寫(xiě)作指導(dǎo) 學(xué)生簽字： 年 月日 指導(dǎo)教師簽字： 年 月日 教研室主任簽字： 年 月日 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畢業(yè)論文考核表 論文題目： 姓名： 學(xué)號(hào)： 專(zhuān)業(yè)：園藝 指導(dǎo)教師評(píng)語(yǔ)： 指導(dǎo)教師（簽字）： 年 月 日 評(píng)閱人評(píng)審意見(jiàn)： 評(píng)閱人（簽字）： 年 月 日 答辯委員會(huì)意見(jiàn)： 主任委員（簽字）： 年 月 日 成績(jī)： 目 錄 ．．．． ．．．．．． ． 29 摘 要 大白菜為兩性花異花傳粉蔬菜作物，雜種優(yōu)勢(shì)十分顯著。 2 資料的整理與分析： 要求條理清晰，數(shù)據(jù)分析詳盡。 3 查閱相關(guān)文獻(xiàn)： 要 求貼近主題，有參考價(jià)值。由于其花器官小，單花結(jié)籽少，而單位面積的播種量又較大，常規(guī)的雜交制種必然存在去雄費(fèi)工、費(fèi)力、成本高等缺點(diǎn)。 主要 研究結(jié)果如下： （ 一）須須根、根、莖、葉、蕾中的 RTPCR 時(shí)序表達(dá)結(jié)果顯示，該基因除在可育花蕾中表達(dá)外，可育植株的其它部位及不育植株中均沒(méi)有表達(dá)。 （ 二）說(shuō)明 BFAPG 基因是一個(gè)受大白菜細(xì)胞核雄性不育基因抑制的 基因 。近年來(lái)，歐美等國(guó)家都已引入并有不同程度的發(fā)展。一代雜種種子的生產(chǎn)是雜種優(yōu)勢(shì)利用的關(guān)鍵步驟之一。大白菜隱性核不育兩用系的利用，解決了利用自交不親和系制種親本繁殖難和生活力下降的難題，但是在生產(chǎn)雜種時(shí)拔除母本行 50%的可育株，增加了育苗成本，此外，如可育株拔除不徹底，使雜交率降低，種子質(zhì)量得不到保證。目前，已在 43 科 162屬 320種的 617個(gè)品種或種間雜種中發(fā)現(xiàn)雄性不育現(xiàn)象 [2]。導(dǎo)致雄性不育的因素是多種多樣的，因此，在分類(lèi)上也因標(biāo)準(zhǔn)不同出現(xiàn)不同的分類(lèi)系統(tǒng)。 隨著與細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因特異作用的核基因的發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)證實(shí)，細(xì) 胞質(zhì)雄性不育僅僅是核質(zhì)互作雄性不育的一個(gè)短暫的過(guò)程，不能被認(rèn)為一種雄性不育類(lèi)型，因此，從不育性的基因型組成角度上劃分，植物雄性不育有核質(zhì)互作雄性不育和細(xì)胞核雄性不育2 種類(lèi)型，細(xì)胞核雄性不育簡(jiǎn)稱(chēng)核不育（ Genie Male sterility,GMS 或 Nuclear Male Sterility,NMS），核質(zhì)互作雄性不育簡(jiǎn)稱(chēng)細(xì)胞質(zhì)不育 (Cytoplasmic Male Sterility,CMS)。而顯性核不育的遺傳，通過(guò)遺傳資料分析并不是單單由一對(duì)基因控制，至少由兩對(duì)或兩對(duì)以上基因控制。當(dāng)這種不育類(lèi)型與細(xì)胞質(zhì)可育父本交配，其子代總是不育的。異花授粉植物自交或近交時(shí)更容易產(chǎn)生不育突變。在誘導(dǎo)產(chǎn)生的雄性不育中，γ射線處理最多，約占 25% ， X 射線占 21%， EMS(ethylmethane sulphonate)占 20%， NUM(Nnitroso Nmethylurethane)占 8%， EI(Ethelene imine)占 6%，秋水仙素占 5%， NEU（ nitrosoethyl urea）占 5%，其它為 10%[3]。如蘿卜不育胞質(zhì)轉(zhuǎn)育到油菜、白菜、甘藍(lán)等作物的轉(zhuǎn)育方法。原生質(zhì)體融合技術(shù)應(yīng)用于蕓薹屬作物改良已愈十年歷史，并在胞質(zhì)基因轉(zhuǎn)移、抗性基因轉(zhuǎn)移及創(chuàng)建新的種質(zhì)等方面取得了一定的成就。 (2)將通過(guò)影響小孢子發(fā)育可導(dǎo)致雄性不育系， Spean 等（ 1992）采用 Rhizogenes 的 rolB 基因與金魚(yú)草 Tap1 啟動(dòng)子融合，轉(zhuǎn)化煙草后發(fā)現(xiàn)花藥生長(zhǎng)素增加，導(dǎo)致雄性不育[4]。 (4)提早降解獲得雄性不育。 (5)細(xì)菌基因在植物中組成型表達(dá)導(dǎo)致植物雄性不育。 差異表達(dá)基因分離方法主要有差示篩選（ differential screening）、扣除雜交（ subtractive hybridization）、 mRNA 差異顯示技術(shù)、 RNA 指紋圖譜技術(shù)（ RNA fingerprting by arbitrary primed PCR )、代表性差異分析方法（ representative differential analysis,RDA）、微陣列技術(shù)、抑制性差減雜交 ( supp ression subtrac tive hybridization, SSH )、cDNAAFLP（ Amplified Fragment Length Polymorphism）技術(shù)，其中應(yīng)該最廣泛的方法為抑制差減雜交（ SSH）。(2)試驗(yàn)組 cDNA分成兩份 ,并與兩個(gè)不同的接頭連接 。(6)篩選文庫(kù)。從技術(shù)本身講 ,提取的 tester RNA 和 driver RNA 及從中分離的 mRNA 的質(zhì)量、限制酶的酶切效率、接頭的連接效率、第二次 PCR 產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化效率及差減克隆的篩選方法等關(guān)系著驗(yàn)的成敗。 李紅霞 等為了深入研究黏類(lèi)小麥雄性不育的分子遺傳機(jī)制 ,利用抑制差減雜交技術(shù)(SHH)構(gòu)建了黏類(lèi)小麥育性相關(guān)基因的 cDNA 文庫(kù)。研究發(fā)現(xiàn)這些基因與育性相關(guān)。在 GenBank 上進(jìn)行 BLAST分析 ,55 個(gè) EST 片段未找到對(duì)應(yīng)的同源序列 ,可能代表了新基因 。同時(shí) ,試驗(yàn)材料中不育系與相應(yīng)的恢復(fù)系為近等基因系 ,這在理論上保證了獲得的差異表達(dá)基因僅與恢復(fù)基因位點(diǎn)有關(guān)。 脂肪酶是一類(lèi)具有多種催化能力的酶，可以催化 三酰甘油 酯及其他一些水不溶性酯類(lèi)的 水解 、醇解、酯化、轉(zhuǎn)酯化及酯類(lèi)的逆向合成反應(yīng)，除此之外還表現(xiàn)出其他一些酶的活性，如 磷脂酶 、溶血磷脂酶、膽固醇酯酶、酰肽水解沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位畢業(yè)論文 7 酶活性等 (Hara； Schmid)。 事實(shí)上，脂肪的水解不是一步完成的，而是分步完成，分步進(jìn)行水解。膜磷脂中含量最高的組分 PE 在不育系 YTA 和可育的同核異質(zhì)系 YTB 之間差異都極顯著 ,YTB 中的含量顯著高于 YTA。線粒體外膜磷脂脂肪酸的組成及不飽和性與總膜的類(lèi)似 ,與總膜及外膜相反 ,YTB 線粒體內(nèi)膜的 IUFA 與 YTA 之間差異不明顯。因此 ,花蕾中游離脯氨酸含量與煙草雄性不育性有密切的關(guān)系 ,不育系花蕾中脯氨沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位畢業(yè)論文 8 酸含量低是雄性不育性導(dǎo)致的結(jié)果 。該基因可能與花粉粒的形成有關(guān)。結(jié)果表明：（ 1） 在小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂期 , 不同育性花藥之間游離脯氨酸的含量無(wú)明顯差異 , 且含量較低。在雌蕊中 , 相應(yīng)于小抱子單核初期時(shí) , 可育株稍高于不育株 , 受精后迅速趨于一致 , 但整個(gè)變化幅度不大。棉花植株遭受化學(xué)殺雄劑脅迫時(shí) ,表現(xiàn)出來(lái)的生理反應(yīng)還有礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素硼、錳、硫、銅、鋅、鎂、鈣、鐵等的吸收、運(yùn)輸受到影響。已經(jīng)獲得的大白菜雄性不育材料，可以分成細(xì)胞核雄性 不育（ GMS）和細(xì)胞質(zhì)雄性不育（ CMS）兩種類(lèi)型。 目前本課題組已建立了一套該材料的應(yīng)用技術(shù)體系，并實(shí)現(xiàn)了品種間和亞種間核不育復(fù)等位基因的交流，育成了多個(gè)新的具有 100%不育株率的雄性不育系 ,但對(duì)其產(chǎn)生雄性不育的分子基理還不清楚。當(dāng)甲型兩用系植株現(xiàn)蕾開(kāi)花后，分別取不育株和可育株花蕾進(jìn)行研究。裝入 管中，液氮速凍后， 85℃冰箱保存?zhèn)溆?裝入 管中，液氮速凍后， 85℃冰箱保存?zhèn)溆?。新的無(wú)水乙醇、氯仿、異丙醇。 4℃ 120xx rpm 離心 10 min，上層水相約 500μl轉(zhuǎn)到新管。加入 700μl漂洗液 RW，室溫靜置 2 min， 4℃ 120xx rpm 離心 30 sec，棄廢液。重復(fù) 1011 操作，合并兩次得到的溶液。 使用 PCR Select cDNA Subtraction Kit(Clontech)提 供的試劑進(jìn)行抑制差減雜交，并根據(jù)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，分別將可育株為測(cè)試組及不育株為測(cè)試組的正向和 反向 SSH 的第二 次 PCR 產(chǎn) 物連接在載體 pGEMTeasy（ Promega） 上，并轉(zhuǎn)化大腸桿 菌 JM109感 受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)在含有 IPTG 和 XGal 的 LB氨 芐培養(yǎng)基上，挑選白色陽(yáng)性克隆 于 96 微孔 板中，分別構(gòu)成正向和反向消減 cDNA 文 庫(kù)，挑取白色克隆 用通用測(cè)序引物 (M 13/pUC Sequencing primer,M13/pUC Reverse Sequencing primer)進(jìn)行 PCR 檢測(cè)。 第一鏈 cDNA 合成反應(yīng) 見(jiàn)表 1： 表 1 第一鏈 cDNA 合成反應(yīng)體系 組分 Components 反應(yīng)體系 Reaction system Template RNA μg 51st Strand Synthesis Buffer μl dNTP Mixture μl RNase Inhibitor μl Oligo(dT)18 μl Reverse Transcriptase（ MMLV）（ 200 U/μl） μl RNaseFree ddH2O 定容 至 μl 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位畢業(yè)論文 11 表 2 RTPCR 中防御相關(guān)基因的引物及退火溫度 Table2The primers and annealing temperature for defense related gene expression experiments 按照上述體系輕柔攪拌混勻各組分，室溫放置 10 分鐘后，移至 42℃ 恒溫水浴槽內(nèi)，反應(yīng) 1 小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后置于冰中冷卻 2 分鐘 線性擴(kuò)增期確定 , 以不同濃度可育株 cDNA 為模板 , 檢測(cè)內(nèi)參基因 ACTIN 在不同循環(huán)數(shù)下產(chǎn)物量的差異 , 找出線性擴(kuò)增期循環(huán)數(shù)作為半定量過(guò)程中的參照循環(huán)數(shù)。μL1 Taq 酶 RNaseFree ddH2O 定容 至 μl PCR 反應(yīng) 程序： PCR 反應(yīng)程序： 基因 引物 序列 (5’ → 3’) 產(chǎn) 物長(zhǎng)度 /bp 退火溫度 /℃ ACTIN F ATCTACGAGGGTTATGCT 412 54 R CCACTGAGGACGATGTTT BFAPG F CATCAAGCCCGACGACCT 412 58 R TGCGAATACTCCACCAAAT 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位畢業(yè)論文 12 將 PCR 反應(yīng)所需的成分配置完后，在 PCR 儀上 94℃ 預(yù)加熱 30 秒，使模板 DNA 充分變性，然后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)。 94℃ 3min 94℃ 30s 54℃ 30S 30 個(gè)循環(huán) 72℃ 30s 72℃ 5min 全長(zhǎng)序列的獲得 利用 本課題組參與的“ 多國(guó)蕓薹屬植物基因組計(jì)劃項(xiàng)目”中大白菜 Chiifu的利用 Chiifu BAC文庫(kù)與基因組測(cè)序結(jié)果信息資源，以 片段 序列試圖調(diào)取全長(zhǎng) cDNA序列 序列相似性搜索 利用 National Center for Biotechnology Information (NCBI)中的 BLAST 工具與 dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行特異表達(dá)基因同源性比較和功能分析，根據(jù)查詢(xún)序列（ Query）與比對(duì)序列（ Sbjct）共同跨越部分長(zhǎng)度（ Alignment scores）、 Evalue 及同源相似性（ Identities）推測(cè)該特異表達(dá)基因的可能生物學(xué)功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn) ,內(nèi)標(biāo)基因在所合成的不育及可育花蕾中均有相似表達(dá)，表明以 ACTIN基因作不育基因研究的內(nèi)標(biāo)基因是可靠的。 1 A GTGA AC T T A A T TGTCGA T A TGTT AA GG GA AA AG A T A TT G GTGTT AA C A T 5 1 T A TT TT C GA T T T 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