【正文】 源基因嵌合，構(gòu)建表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化植物來阻斷花粉發(fā)育的過程從而達(dá)到雄性不育的目的。 (1)表達(dá)細(xì)胞霉素基因破壞花藥絨氈層創(chuàng)造雄性不育，絨氈層是顯花植物花粉發(fā) 育過程中一種獨(dú)特的分泌細(xì)胞，其活躍的代謝與花粉的發(fā)育有著密切聯(lián)系。 (2)將通過影響小孢子發(fā)育可導(dǎo)致雄性不育系， Spean 等（ 1992）采用 Rhizogenes 的 rolB 基因與金魚草 Tap1 啟動子融合，轉(zhuǎn)化煙草后發(fā)現(xiàn)花藥生長素增加，導(dǎo)致雄性不育[4]。 (3)利用反義 RNA 技術(shù)獲得植物雄性不育?；ǚ郯l(fā)育是一個及其復(fù)雜的過程，許多基因與花粉發(fā)育有關(guān)。通過反義 RNA 技術(shù)阻斷與花粉發(fā)育有關(guān)的基因的表達(dá)用樣可以獲得雄性不育株。 (4)提早降解獲得雄性不育。是在孢母細(xì)胞減數(shù)分裂完成后作為小孢子的臨 時膜，以分隔產(chǎn)生的四分孢子，防止它們之間相互粘連和融合。絨氈層中的合成與分泌的特異性對于花粉的正常發(fā)育具有決定性作用。正常情況下，在小孢子形成外壁后， Curtis 等（ 1996）將β 3葡聚糖酶連接在 PSL 啟動子之下，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法也獲得了萵苣的雄性不育株 [5]。 (5)細(xì)菌基因在植物中組成型表達(dá)導(dǎo)致植物雄性不育。 Schmulling(1988)等將農(nóng)桿菌 TDNA 間的 rolC 基因與 CaMV35S 啟動子串聯(lián)成嵌合基因轉(zhuǎn)化煙草，獲得雄性不育株。 (6)隨著分子水平的研究不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)細(xì) 胞質(zhì)雄性不育與線粒體基因有密切沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位畢業(yè)論文 5 關(guān)，現(xiàn)在已在玉米、矮牽牛、油菜等線粒體 DNA 上找到了與 CMS 有關(guān)的基因。通過基因工程的方法擾亂線粒體與細(xì)胞核之間信息交流，可導(dǎo)致雄性不育。 差異表達(dá)基因分離方法主要有差示篩選（ differential screening）、扣除雜交（ subtractive hybridization）、 mRNA 差異顯示技術(shù)、 RNA 指紋圖譜技術(shù)（ RNA fingerprting by arbitrary primed PCR )、代表性差異分析方法（ representative differential analysis,RDA）、微陣列技術(shù)、抑制性差減雜交 ( supp ression subtrac tive hybridization, SSH )、cDNAAFLP（ Amplified Fragment Length Polymorphism）技術(shù)，其中應(yīng)該最廣泛的方法為抑制差減雜交（ SSH）。 SSH 的基本原理 抑制差減雜交技術(shù)運(yùn)用了雜交二級動力學(xué)原理 ,即高豐度的單鏈 cDNA 在退火時產(chǎn)生同源雜交的速度快于低豐度的單鏈 cDNA,在試驗(yàn)組 (tester)和驅(qū)動組 (driver)的 cDNA變性后再復(fù)性的過程中 ,原來在豐度上有差別的單鏈 cDNA 達(dá)到均一化。同時 ,由于試驗(yàn)組的 cDNA 在進(jìn)行雜交之前等分的兩份加有不同的接頭 ,因此雜交時將產(chǎn)生 5 種不同類型的分子 a、 b、 c、 d 和 e(圖 1),當(dāng)采用與兩個不同接頭序列互補(bǔ)的引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增時 ,只有目標(biāo)序列得到有效擴(kuò)增 ,非目標(biāo)序列因兩端存在反向重復(fù)序列 ,退火時易產(chǎn)生類似”鍋柄”的結(jié)構(gòu) ,無法與引物配對 ,擴(kuò)增受到抑制。 抑制差減雜交 (SSH)技術(shù)的主要步驟 步驟 :(1)cDNA的合成與酶切 。(2)試驗(yàn)組 cDNA分成兩份 ,并與兩個不同的接頭連接 。(3)試驗(yàn)組的 cDNA 與過量的驅(qū)動組 cDNA 雜交 。(4)選擇性 PCR 擴(kuò)增與接頭相連的試驗(yàn)組 cDNA 分子 。(5)克隆 PCR 產(chǎn)物 ,構(gòu)建差減文庫 。(6)篩選文庫。 抑制差減雜交 (SSH)技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)：抑制差減雜交 ( suppression subtractive hybridization, SSH)是基于抑制 PCR 和差減雜交技術(shù)建立的簡單有效的方法 [1],通過一次差減雜交可使低豐度的序列 (mRNA)得以高于 1000 倍的富集 ,有效的選擇性擴(kuò)增目標(biāo)序列 ,同時抑制 非目標(biāo)序列的擴(kuò)增 ,因此在分離基因特別是分離低豐度差異表達(dá)基因方面具有更廣闊的應(yīng)用前景。 缺點(diǎn)： SSH 方法一般只用于兩個樣品的差異比較分析 ,樣品間的差異不宜太大或太小 ,而對于多個樣品則無能為力 ,這在很大程度上限制了它的應(yīng)用。提取 tester RNA 的時期非常關(guān)鍵 ,選擇使用該方法時 ,首先要根據(jù)不同的研究目的確定取材的最佳時期 ,取材時期不當(dāng)將會給試驗(yàn)帶來意想不到的困難 ,或許只得到很少幾個差減克隆或根本得不到克隆 ,或得到一些非目的克隆。從技術(shù)本身講 ,提取的 tester RNA 和 driver RNA 及從中分離的 mRNA 的質(zhì)量、限制酶的酶切效率、接頭的連接效率、第二次 PCR 產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化效率及差減克隆的篩選方法等關(guān)系著驗(yàn)的成敗。另外 SSH 所需的起始 RNA 量較大 ,一般為幾微克 ,對于一些珍貴稀有的不易獲得足夠 RNA 的材料要慎重使用。 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位畢業(yè)論文 6 SSH 技術(shù)自 1996 年提出以來 ,在動物研究領(lǐng)域中 ,已成功地應(yīng)用到許多分子遺傳學(xué)和基因克隆的研究中 ,如鑒別病理變化、生物體生長發(fā) 育、組織分化中的基因表達(dá)變化以及其他差別表達(dá)的基因。自 1999 年 Birch 等在對馬鈴薯晚疫病的研究中第一次將此技術(shù) 成功運(yùn)用于植物領(lǐng)域后 ,近年來這一技術(shù)在植物方面的應(yīng)用也取得了很大的進(jìn)展 ,已將 SSH 方法應(yīng)用到水稻、玉米、小麥、馬鈴薯、大豆、辣椒、胡蘿卜、大麥、棉花、康乃馨、擬南芥、甘蔗、甜菜、人參、芒果、灌。 李紅霞 等為了深入研究黏類小麥雄性不育的分子遺傳機(jī)制 ,利用抑制差減雜交技術(shù)(SHH)構(gòu)建了黏類小麥育性相關(guān)基因的 cDNA 文庫。文庫質(zhì)量檢測表明 ,差減雜交效率較高 ,質(zhì)量較好。在不育和可育 cDNA 文庫中隨機(jī)挑選 120 個陽性克隆進(jìn)行測序 ,獲得 100余條高質(zhì)量的表達(dá)序列標(biāo)簽 (EST)。對序列進(jìn)行 BLAST 比對及功能注釋 ,cDNA 文庫的基因表達(dá)譜 ,發(fā)現(xiàn)在可育 cDNA 文庫中參與能量代謝的基因出現(xiàn)頻率較高 ,在不育 cDNA 文庫中檢測到了與花發(fā)育調(diào)控相關(guān)的 MADSbox 轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞凋亡相關(guān)的泛素結(jié)合酶及阻遏淀粉合成的腺苷二磷酸葡萄糖磷酸化酶等相關(guān)基因。研究發(fā)現(xiàn)這些基因與育性相關(guān)。 郭爽 等以辣椒 (Capsicum annuum L.)細(xì)胞質(zhì)雄性不育系 23A、 121A 和其相應(yīng)的近等基因恢復(fù)系 23C、 121C 為試驗(yàn)材料 ,利用抑制差減雜交 (SSH)技術(shù)成功構(gòu)建了 CMS 恢復(fù)基因誘導(dǎo)表達(dá)的消減 cDNA 文庫。結(jié)合高密度點(diǎn)陣膜雜交差 異篩選 ,獲得了 282 個陽性克隆。通過測序 ,除去重復(fù)序列共得到 175 個 Unique ESTs。在 GenBank 上進(jìn)行 BLAST分析 ,55 個 EST 片段未找到對應(yīng)的同源序列 ,可能代表了新基因 。120 個 EST 片段找到了對應(yīng)的同源序列 ,包括 103 個已知功能基因和 17 個未知功能基因。按照 MIPS 功能分類法 ,將其分為 14 個功能組 ,涉及代謝、脅迫應(yīng)答、蛋白活性、轉(zhuǎn)錄因子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多方面的功能。辣椒 CMS 類型已鑒定出有關(guān)的線粒體基因 (Kim etal,20xx),但相關(guān)的核育性恢復(fù)基因的分離克隆研究較少劉忠松 等 ,20xx,從辣椒 CMS 育性恢復(fù)相關(guān)基因入手 ,利用SSH技術(shù)分離辣椒 CMS育性恢復(fù)相關(guān) ESTs,構(gòu)建辣椒 CM S育性恢復(fù)相關(guān) cDNA 文庫 ,為進(jìn)一步對辣椒育性恢復(fù)相關(guān)基因進(jìn)行深入研究奠定基礎(chǔ)。同時 ,試驗(yàn)材料中不育系與相應(yīng)的恢復(fù)系為近等基因系 ,這在理論上保證了獲得的差異表達(dá)基因僅與恢復(fù)基因位點(diǎn)有關(guān)。 3 脂肪酶的作用 脂肪酶即三酰基甘油?；饷?，它催化天然底物 油脂水解 ， 生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯。 脂肪酶基本組成單位僅為 氨基酸 ，通常只有一條多肽鏈。它的催化活性僅僅決定于它的 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 。 脂肪酶是一類具有多種催化能力的酶，可以催化 三酰甘油 酯及其他一些水不溶性酯類的 水解 、醇解、酯化、轉(zhuǎn)酯化及酯類的逆向合成反應(yīng)，除此之外還表現(xiàn)出其他一些酶的活性，如 磷脂酶 、溶血磷脂酶、膽固醇酯酶、酰肽水解沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位畢業(yè)論文 7 酶活性等 (Hara； Schmid)。脂肪酶不同活性的發(fā)揮依賴于反應(yīng)體系的特點(diǎn)，如在油水界面促進(jìn)酯水解，而在有機(jī)相中可以酶促合成和酯交換。脂肪酶廣泛的存在于動植物和 微生物 中。植物中含脂肪酶較多的是油料作物的種子，如蓖麻籽、油菜籽，當(dāng)油料種子發(fā)芽時，脂肪酶能與其他的酶協(xié)同發(fā)揮作用催化分解油脂類物質(zhì)生成糖類，提供種子生根發(fā)芽所必需的養(yǎng)料和能量； 4 脂肪酸代謝與雄性不育 生物體內(nèi)脂肪是由脂肪酶水解，在脂肪酶的催化下生成 一分子甘油和三分子脂肪酸，脂肪酶的特點(diǎn)：主要作用于有酯鍵的化合物，不論脂肪來源于什么組織，不論脂肪酸碳鏈的長短，只要是酯鍵，脂肪酶就可以使其斷裂，這就是酶的專一性即鍵專一性。 事實(shí)上，脂肪的水解不是一步完成的，而是分步完成，分步進(jìn)行水解。第一步脂肪酶水解第一或第三全酯鍵，即 α或α′酯鍵，如果第一步水解α 酯鍵，第二水解α′酯鍵，生成α和α′脂肪酸和甘油 酯，最后，β 位的脂肪酸在轉(zhuǎn)移酶的催化下β 的脂肪酸轉(zhuǎn)到α或α′位上，再在脂肪酶的作用下，脂肪酸水解下來，共生成三分子脂肪酸和一分子甘油，水解過程為： 脂肪 （甘油三酯）水解的產(chǎn)物：一分子甘油和三分子脂肪酸。 分別用 HPLC 和 GC 分析了紅蓮型細(xì)胞質(zhì)雄性不育水稻同核異質(zhì)系 YTA 和 YTB 線粒體總膜、內(nèi)膜以及外膜磷脂類型和脂肪酸的各組分 ,并用面積歸一化法定量分析了各種膜磷脂組分和脂肪酸的含量配比。結(jié)果表明同核異質(zhì)但育性不同的 YTA 和 YTB 之間線粒體膜磷脂組分和脂肪酸配比存在明顯的差異 ,并且二者在外膜之間的差異明顯大于內(nèi)膜。膜磷脂中含量最高的組分 PE 在不育系 YTA 和可育的同核異質(zhì)系 YTB 之間差異都極顯著 ,YTB 中的含量顯著高于 YTA?？偰ず蛢?nèi)膜中 PI 含量差異顯著 ,均為 YTA 中的含量高于 YTB,而 PA 含量均差異不明顯 。相對于內(nèi)膜 ,外膜的膜磷脂含量在 YTA 與同核異質(zhì)的 YTB 間差異更大 ,尤其是 PE、 PA 和 PC 的含量。對于線粒體總膜磷脂中含量最高的脂肪酸組分 18C:0 在不育系 YTA 中的含量極顯著高于同核異質(zhì)的 YTB,而多不飽和脂肪酸 (N:2 和 N:3)含量和 IUFA 則是 YTB 極顯著高于 YTA。線粒體外膜磷脂脂肪酸的組成及不飽和性與總膜的類似 ,與總膜及外膜相反 ,YTB 線粒體內(nèi)膜的 IUFA 與 YTA 之間差異不明顯。這說明線粒體的膜磷脂組分和脂肪酸配比可能受細(xì)胞質(zhì)基因影響 ,與 HLCMS 的育性可能具有一定的聯(lián)系。 劉齊元（ 20xx）煙草游離脯氨酸含量與雄性不育性的關(guān)系結(jié)果表明 ,花蕾中不育系的脯氨酸含量在小花蕾階段與其保持系非常接近 ,但從中花蕾開始 ,保持系花蕾中的脯氨酸含量急劇上升 ,而不育系花蕾中的脯氨酸含量則基本保持穩(wěn)定 ,因而 ,不育系花蕾中的脯氨酸含量在大花蕾時期明顯低于其保持系 。葉片中生育前期不育系的游離脯氨酸含量和相應(yīng)保持系之間基本上沒有大的差異 ,僅在生育后期存在一定的差異 ,但這些差 異變化無規(guī)律性。因此 ,花蕾中游離脯氨酸含量與煙草雄性不育性有密切的關(guān)系 ,不育系花蕾中脯氨沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位畢業(yè)論文 8 酸含量低是雄性不育性導(dǎo)致的結(jié)果 。葉片中游離脯氨酸含量與煙草雄性不育性沒有直接關(guān)系。 5. 花粉囊專一性的脯氨酸富集蛋白（ antherspecific prolinerich protein， APG） 的功能 花粉囊專一性的脯氨酸富集蛋白（ antherspecific prolinerich protein， APG） Roberts等人（ 1993）發(fā)現(xiàn) antherspecific prolinerich protein， APG 表現(xiàn)于在阿拉伯芥菜 Brssica napus 的花藥中，他們以 APG promoter 啟動基因并轉(zhuǎn)植到 中表現(xiàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因在許多不同種類花朵細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)。 Amr Ageez 等（ 20xx）在研究 叉枝蠅子草 雄性不育雄性不育相關(guān)基因表達(dá)時分離到了 APG 基因，并將其命名為 SIAPG, 表明 SIAPG僅在花藥中表達(dá)，在雌蕊中不表達(dá)。該基因可能與花粉粒的形成有關(guān)。 6. 花粉囊專一性的脯氨酸富集蛋白 在不育中研究現(xiàn)狀。 一般認(rèn)為 , 花藥中游離氨基酸含量 , 尤其是游離脯氨酸含量與花粉育性 有密切關(guān)系。 朱廣廉等曾對顯性單基因控制的太谷核不育小麥不同發(fā)育階段的可育株和不育株的花藥及雌蕊內(nèi)游離脯氨酸和游離總氨基酸的含量進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：（ 1） 在小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂期 , 不同育性花藥之間游離脯氨酸的含量無明顯差異 , 且含量較低。（ 2） 在小孢子單核初期 , 可育花藥內(nèi)游離脯氨酸的含量顯著高于不育花藥 , 是不育花藥的 7 倍 , 比減數(shù)分裂期增加 20 倍 , 高達(dá)其干重的 %, 占其游離總氨基酸的 50%。（ 3）在雌蕊中 , 游離脯氨酸的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于花藥 , 不同育性植株之間差異不很明顯。（ 4）關(guān)于游離總氨 基酸的含量 , 在花藥中減數(shù)分裂期 , 不同育性植株之間無明顯差異；在小孢子單核初期 , 可育株高于不育株。在雌