【正文】 源基因嵌合，構(gòu)建表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化植物來(lái)阻斷花粉發(fā)育的過(guò)程從而達(dá)到雄性不育的目的。 (1)表達(dá)細(xì)胞霉素基因破壞花藥絨氈層創(chuàng)造雄性不育，絨氈層是顯花植物花粉發(fā) 育過(guò)程中一種獨(dú)特的分泌細(xì)胞，其活躍的代謝與花粉的發(fā)育有著密切聯(lián)系。 (2)將通過(guò)影響小孢子發(fā)育可導(dǎo)致雄性不育系， Spean 等（ 1992）采用 Rhizogenes 的 rolB 基因與金魚(yú)草 Tap1 啟動(dòng)子融合，轉(zhuǎn)化煙草后發(fā)現(xiàn)花藥生長(zhǎng)素增加，導(dǎo)致雄性不育[4]。 (3)利用反義 RNA 技術(shù)獲得植物雄性不育。花粉發(fā)育是一個(gè)及其復(fù)雜的過(guò)程，許多基因與花粉發(fā)育有關(guān)。通過(guò)反義 RNA 技術(shù)阻斷與花粉發(fā)育有關(guān)的基因的表達(dá)用樣可以獲得雄性不育株。 (4)提早降解獲得雄性不育。是在孢母細(xì)胞減數(shù)分裂完成后作為小孢子的臨 時(shí)膜，以分隔產(chǎn)生的四分孢子，防止它們之間相互粘連和融合。絨氈層中的合成與分泌的特異性對(duì)于花粉的正常發(fā)育具有決定性作用。正常情況下，在小孢子形成外壁后， Curtis 等（ 1996）將β 3葡聚糖酶連接在 PSL 啟動(dòng)子之下，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法也獲得了萵苣的雄性不育株 [5]。 (5)細(xì)菌基因在植物中組成型表達(dá)導(dǎo)致植物雄性不育。 Schmulling(1988)等將農(nóng)桿菌 TDNA 間的 rolC 基因與 CaMV35S 啟動(dòng)子串聯(lián)成嵌合基因轉(zhuǎn)化煙草，獲得雄性不育株。 (6)隨著分子水平的研究不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)細(xì) 胞質(zhì)雄性不育與線粒體基因有密切沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位畢業(yè)論文 5 關(guān)，現(xiàn)在已在玉米、矮牽牛、油菜等線粒體 DNA 上找到了與 CMS 有關(guān)的基因。通過(guò)基因工程的方法擾亂線粒體與細(xì)胞核之間信息交流，可導(dǎo)致雄性不育。 差異表達(dá)基因分離方法主要有差示篩選（ differential screening）、扣除雜交（ subtractive hybridization）、 mRNA 差異顯示技術(shù)、 RNA 指紋圖譜技術(shù)（ RNA fingerprting by arbitrary primed PCR )、代表性差異分析方法（ representative differential analysis,RDA）、微陣列技術(shù)、抑制性差減雜交 ( supp ression subtrac tive hybridization, SSH )、cDNAAFLP（ Amplified Fragment Length Polymorphism）技術(shù)，其中應(yīng)該最廣泛的方法為抑制差減雜交（ SSH）。 SSH 的基本原理 抑制差減雜交技術(shù)運(yùn)用了雜交二級(jí)動(dòng)力學(xué)原理 ,即高豐度的單鏈 cDNA 在退火時(shí)產(chǎn)生同源雜交的速度快于低豐度的單鏈 cDNA,在試驗(yàn)組 (tester)和驅(qū)動(dòng)組 (driver)的 cDNA變性后再?gòu)?fù)性的過(guò)程中 ,原來(lái)在豐度上有差別的單鏈 cDNA 達(dá)到均一化。同時(shí) ,由于試驗(yàn)組的 cDNA 在進(jìn)行雜交之前等分的兩份加有不同的接頭 ,因此雜交時(shí)將產(chǎn)生 5 種不同類(lèi)型的分子 a、 b、 c、 d 和 e(圖 1),當(dāng)采用與兩個(gè)不同接頭序列互補(bǔ)的引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增時(shí) ,只有目標(biāo)序列得到有效擴(kuò)增 ,非目標(biāo)序列因兩端存在反向重復(fù)序列 ,退火時(shí)易產(chǎn)生類(lèi)似”鍋柄”的結(jié)構(gòu) ,無(wú)法與引物配對(duì) ,擴(kuò)增受到抑制。 抑制差減雜交 (SSH)技術(shù)的主要步驟 步驟 :(1)cDNA的合成與酶切 。(2)試驗(yàn)組 cDNA分成兩份 ,并與兩個(gè)不同的接頭連接 。(3)試驗(yàn)組的 cDNA 與過(guò)量的驅(qū)動(dòng)組 cDNA 雜交 。(4)選擇性 PCR 擴(kuò)增與接頭相連的試驗(yàn)組 cDNA 分子 。(5)克隆 PCR 產(chǎn)物 ,構(gòu)建差減文庫(kù) 。(6)篩選文庫(kù)。 抑制差減雜交 (SSH)技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)：抑制差減雜交 ( suppression subtractive hybridization, SSH)是基于抑制 PCR 和差減雜交技術(shù)建立的簡(jiǎn)單有效的方法 [1],通過(guò)一次差減雜交可使低豐度的序列 (mRNA)得以高于 1000 倍的富集 ,有效的選擇性擴(kuò)增目標(biāo)序列 ,同時(shí)抑制 非目標(biāo)序列的擴(kuò)增 ,因此在分離基因特別是分離低豐度差異表達(dá)基因方面具有更廣闊的應(yīng)用前景。 缺點(diǎn)： SSH 方法一般只用于兩個(gè)樣品的差異比較分析 ,樣品間的差異不宜太大或太小 ,而對(duì)于多個(gè)樣品則無(wú)能為力 ,這在很大程度上限制了它的應(yīng)用。提取 tester RNA 的時(shí)期非常關(guān)鍵 ,選擇使用該方法時(shí) ,首先要根據(jù)不同的研究目的確定取材的最佳時(shí)期 ,取材時(shí)期不當(dāng)將會(huì)給試驗(yàn)帶來(lái)意想不到的困難 ,或許只得到很少幾個(gè)差減克隆或根本得不到克隆 ,或得到一些非目的克隆。從技術(shù)本身講 ,提取的 tester RNA 和 driver RNA 及從中分離的 mRNA 的質(zhì)量、限制酶的酶切效率、接頭的連接效率、第二次 PCR 產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化效率及差減克隆的篩選方法等關(guān)系著驗(yàn)的成敗。另外 SSH 所需的起始 RNA 量較大 ,一般為幾微克 ,對(duì)于一些珍貴稀有的不易獲得足夠 RNA 的材料要慎重使用。 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位畢業(yè)論文 6 SSH 技術(shù)自 1996 年提出以來(lái) ,在動(dòng)物研究領(lǐng)域中 ,已成功地應(yīng)用到許多分子遺傳學(xué)和基因克隆的研究中 ,如鑒別病理變化、生物體生長(zhǎng)發(fā) 育、組織分化中的基因表達(dá)變化以及其他差別表達(dá)的基因。自 1999 年 Birch 等在對(duì)馬鈴薯晚疫病的研究中第一次將此技術(shù) 成功運(yùn)用于植物領(lǐng)域后 ,近年來(lái)這一技術(shù)在植物方面的應(yīng)用也取得了很大的進(jìn)展 ,已將 SSH 方法應(yīng)用到水稻、玉米、小麥、馬鈴薯、大豆、辣椒、胡蘿卜、大麥、棉花、康乃馨、擬南芥、甘蔗、甜菜、人參、芒果、灌。 李紅霞 等為了深入研究黏類(lèi)小麥雄性不育的分子遺傳機(jī)制 ,利用抑制差減雜交技術(shù)(SHH)構(gòu)建了黏類(lèi)小麥育性相關(guān)基因的 cDNA 文庫(kù)。文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)表明 ,差減雜交效率較高 ,質(zhì)量較好。在不育和可育 cDNA 文庫(kù)中隨機(jī)挑選 120 個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序 ,獲得 100余條高質(zhì)量的表達(dá)序列標(biāo)簽 (EST)。對(duì)序列進(jìn)行 BLAST 比對(duì)及功能注釋 ,cDNA 文庫(kù)的基因表達(dá)譜 ,發(fā)現(xiàn)在可育 cDNA 文庫(kù)中參與能量代謝的基因出現(xiàn)頻率較高 ,在不育 cDNA 文庫(kù)中檢測(cè)到了與花發(fā)育調(diào)控相關(guān)的 MADSbox 轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞凋亡相關(guān)的泛素結(jié)合酶及阻遏淀粉合成的腺苷二磷酸葡萄糖磷酸化酶等相關(guān)基因。研究發(fā)現(xiàn)這些基因與育性相關(guān)。 郭爽 等以辣椒 (Capsicum annuum L.)細(xì)胞質(zhì)雄性不育系 23A、 121A 和其相應(yīng)的近等基因恢復(fù)系 23C、 121C 為試驗(yàn)材料 ,利用抑制差減雜交 (SSH)技術(shù)成功構(gòu)建了 CMS 恢復(fù)基因誘導(dǎo)表達(dá)的消減 cDNA 文庫(kù)。結(jié)合高密度點(diǎn)陣膜雜交差 異篩選 ,獲得了 282 個(gè)陽(yáng)性克隆。通過(guò)測(cè)序 ,除去重復(fù)序列共得到 175 個(gè) Unique ESTs。在 GenBank 上進(jìn)行 BLAST分析 ,55 個(gè) EST 片段未找到對(duì)應(yīng)的同源序列 ,可能代表了新基因 。120 個(gè) EST 片段找到了對(duì)應(yīng)的同源序列 ,包括 103 個(gè)已知功能基因和 17 個(gè)未知功能基因。按照 MIPS 功能分類(lèi)法 ,將其分為 14 個(gè)功能組 ,涉及代謝、脅迫應(yīng)答、蛋白活性、轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多方面的功能。辣椒 CMS 類(lèi)型已鑒定出有關(guān)的線粒體基因 (Kim etal,20xx),但相關(guān)的核育性恢復(fù)基因的分離克隆研究較少劉忠松 等 ,20xx,從辣椒 CMS 育性恢復(fù)相關(guān)基因入手 ,利用SSH技術(shù)分離辣椒 CMS育性恢復(fù)相關(guān) ESTs,構(gòu)建辣椒 CM S育性恢復(fù)相關(guān) cDNA 文庫(kù) ,為進(jìn)一步對(duì)辣椒育性恢復(fù)相關(guān)基因進(jìn)行深入研究奠定基礎(chǔ)。同時(shí) ,試驗(yàn)材料中不育系與相應(yīng)的恢復(fù)系為近等基因系 ,這在理論上保證了獲得的差異表達(dá)基因僅與恢復(fù)基因位點(diǎn)有關(guān)。 3 脂肪酶的作用 脂肪酶即三?；视王；饷?，它催化天然底物 油脂水解 ， 生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯。 脂肪酶基本組成單位僅為 氨基酸 ，通常只有一條多肽鏈。它的催化活性?xún)H僅決定于它的 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 。 脂肪酶是一類(lèi)具有多種催化能力的酶，可以催化 三酰甘油 酯及其他一些水不溶性酯類(lèi)的 水解 、醇解、酯化、轉(zhuǎn)酯化及酯類(lèi)的逆向合成反應(yīng)，除此之外還表現(xiàn)出其他一些酶的活性，如 磷脂酶 、溶血磷脂酶、膽固醇酯酶、酰肽水解沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位畢業(yè)論文 7 酶活性等 (Hara； Schmid)。脂肪酶不同活性的發(fā)揮依賴(lài)于反應(yīng)體系的特點(diǎn)，如在油水界面促進(jìn)酯水解，而在有機(jī)相中可以酶促合成和酯交換。脂肪酶廣泛的存在于動(dòng)植物和 微生物 中。植物中含脂肪酶較多的是油料作物的種子，如蓖麻籽、油菜籽，當(dāng)油料種子發(fā)芽時(shí)，脂肪酶能與其他的酶協(xié)同發(fā)揮作用催化分解油脂類(lèi)物質(zhì)生成糖類(lèi)，提供種子生根發(fā)芽所必需的養(yǎng)料和能量； 4 脂肪酸代謝與雄性不育 生物體內(nèi)脂肪是由脂肪酶水解，在脂肪酶的催化下生成 一分子甘油和三分子脂肪酸，脂肪酶的特點(diǎn)：主要作用于有酯鍵的化合物，不論脂肪來(lái)源于什么組織，不論脂肪酸碳鏈的長(zhǎng)短，只要是酯鍵，脂肪酶就可以使其斷裂，這就是酶的專(zhuān)一性即鍵專(zhuān)一性。 事實(shí)上，脂肪的水解不是一步完成的，而是分步完成，分步進(jìn)行水解。第一步脂肪酶水解第一或第三全酯鍵，即 α或α′酯鍵，如果第一步水解α 酯鍵，第二水解α′酯鍵，生成α和α′脂肪酸和甘油 酯，最后，β 位的脂肪酸在轉(zhuǎn)移酶的催化下β 的脂肪酸轉(zhuǎn)到α或α′位上，再在脂肪酶的作用下，脂肪酸水解下來(lái)，共生成三分子脂肪酸和一分子甘油，水解過(guò)程為： 脂肪 （甘油三酯）水解的產(chǎn)物：一分子甘油和三分子脂肪酸。 分別用 HPLC 和 GC 分析了紅蓮型細(xì)胞質(zhì)雄性不育水稻同核異質(zhì)系 YTA 和 YTB 線粒體總膜、內(nèi)膜以及外膜磷脂類(lèi)型和脂肪酸的各組分 ,并用面積歸一化法定量分析了各種膜磷脂組分和脂肪酸的含量配比。結(jié)果表明同核異質(zhì)但育性不同的 YTA 和 YTB 之間線粒體膜磷脂組分和脂肪酸配比存在明顯的差異 ,并且二者在外膜之間的差異明顯大于內(nèi)膜。膜磷脂中含量最高的組分 PE 在不育系 YTA 和可育的同核異質(zhì)系 YTB 之間差異都極顯著 ,YTB 中的含量顯著高于 YTA?？偰ず蛢?nèi)膜中 PI 含量差異顯著 ,均為 YTA 中的含量高于 YTB,而 PA 含量均差異不明顯 。相對(duì)于內(nèi)膜 ,外膜的膜磷脂含量在 YTA 與同核異質(zhì)的 YTB 間差異更大 ,尤其是 PE、 PA 和 PC 的含量。對(duì)于線粒體總膜磷脂中含量最高的脂肪酸組分 18C:0 在不育系 YTA 中的含量極顯著高于同核異質(zhì)的 YTB,而多不飽和脂肪酸 (N:2 和 N:3)含量和 IUFA 則是 YTB 極顯著高于 YTA。線粒體外膜磷脂脂肪酸的組成及不飽和性與總膜的類(lèi)似 ,與總膜及外膜相反 ,YTB 線粒體內(nèi)膜的 IUFA 與 YTA 之間差異不明顯。這說(shuō)明線粒體的膜磷脂組分和脂肪酸配比可能受細(xì)胞質(zhì)基因影響 ,與 HLCMS 的育性可能具有一定的聯(lián)系。 劉齊元（ 20xx）煙草游離脯氨酸含量與雄性不育性的關(guān)系結(jié)果表明 ,花蕾中不育系的脯氨酸含量在小花蕾階段與其保持系非常接近 ,但從中花蕾開(kāi)始 ,保持系花蕾中的脯氨酸含量急劇上升 ,而不育系花蕾中的脯氨酸含量則基本保持穩(wěn)定 ,因而 ,不育系花蕾中的脯氨酸含量在大花蕾時(shí)期明顯低于其保持系 。葉片中生育前期不育系的游離脯氨酸含量和相應(yīng)保持系之間基本上沒(méi)有大的差異 ,僅在生育后期存在一定的差異 ,但這些差 異變化無(wú)規(guī)律性。因此 ,花蕾中游離脯氨酸含量與煙草雄性不育性有密切的關(guān)系 ,不育系花蕾中脯氨沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位畢業(yè)論文 8 酸含量低是雄性不育性導(dǎo)致的結(jié)果 。葉片中游離脯氨酸含量與煙草雄性不育性沒(méi)有直接關(guān)系。 5. 花粉囊專(zhuān)一性的脯氨酸富集蛋白（ antherspecific prolinerich protein， APG） 的功能 花粉囊專(zhuān)一性的脯氨酸富集蛋白（ antherspecific prolinerich protein， APG） Roberts等人（ 1993）發(fā)現(xiàn) antherspecific prolinerich protein， APG 表現(xiàn)于在阿拉伯芥菜 Brssica napus 的花藥中，他們以 APG promoter 啟動(dòng)基因并轉(zhuǎn)植到 中表現(xiàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因在許多不同種類(lèi)花朵細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)。 Amr Ageez 等（ 20xx）在研究 叉枝蠅子草 雄性不育雄性不育相關(guān)基因表達(dá)時(shí)分離到了 APG 基因，并將其命名為 SIAPG, 表明 SIAPG僅在花藥中表達(dá)，在雌蕊中不表達(dá)。該基因可能與花粉粒的形成有關(guān)。 6. 花粉囊專(zhuān)一性的脯氨酸富集蛋白 在不育中研究現(xiàn)狀。 一般認(rèn)為 , 花藥中游離氨基酸含量 , 尤其是游離脯氨酸含量與花粉育性 有密切關(guān)系。 朱廣廉等曾對(duì)顯性單基因控制的太谷核不育小麥不同發(fā)育階段的可育株和不育株的花藥及雌蕊內(nèi)游離脯氨酸和游離總氨基酸的含量進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：（ 1） 在小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂期 , 不同育性花藥之間游離脯氨酸的含量無(wú)明顯差異 , 且含量較低。（ 2） 在小孢子單核初期 , 可育花藥內(nèi)游離脯氨酸的含量顯著高于不育花藥 , 是不育花藥的 7 倍 , 比減數(shù)分裂期增加 20 倍 , 高達(dá)其干重的 %, 占其游離總氨基酸的 50%。（ 3）在雌蕊中 , 游離脯氨酸的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于花藥 , 不同育性植株之間差異不很明顯。（ 4）關(guān)于游離總氨 基酸的含量 , 在花藥中減數(shù)分裂期 , 不同育性植株之間無(wú)明顯差異；在小孢子單核初期 , 可育株高于不育株。在雌