【正文】 驗中的各個實驗環(huán)節(jié)和步驟的掌握，儀器的使用，方法的了解 數(shù)據(jù)的整理，文獻和綜述的整理 論文 的整體規(guī)劃和寫作 論文寫作指導 學生簽字： 年 月日 指導教師簽字： 年 月日 教研室主任簽字： 年 月日 沈陽農(nóng)業(yè)大學畢業(yè)論文考核表 論文題目： 姓名： 學號： 專業(yè)：園藝 指導教師評語： 指導教師（簽字）： 年 月 日 評閱人評審意見： 評閱人（簽字）： 年 月 日 答辯委員會意見： 主任委員（簽字）： 年 月 日 成績： 目 錄 ．．．． ．．．．．． ． 29 摘 要 大白菜為兩性花異花傳粉蔬菜作物，雜種優(yōu)勢十分顯著。表明該基因為大白菜花蕾發(fā)育調(diào)控基因，它對育性控制發(fā)生在花蕾發(fā)生初期就已起作用。 大白菜為典型的異花授粉作物，品種或自交系間一代雜種存在明顯的雜種優(yōu)勢，國內(nèi)外白菜的優(yōu)良品種已絕大部分為一代雜種。早在 1863 年Kolreuter 就觀察到雄性不育現(xiàn)象，一個世紀后 Coleman 首先引入“植物雄性不育”的概念。 Kaul在總結(jié)前人研究的基礎(chǔ)上將植物雄性不育歸納為非遺傳型和可遺傳型 2 大類。 3） 細胞質(zhì)雄性不育 這種類型的不育性完全受細胞質(zhì)遺傳物質(zhì)所主宰，與核基 因無關(guān)，其遺傳方式為母性遺傳。 3） 理化誘導 物理和化學誘變劑單獨或聯(lián)合處理 已在 35 個種中誘導產(chǎn)生雄性不育性。應用 原生質(zhì)體融合技術(shù)不但可以使一個種的雄性不育細胞質(zhì)與另一個種的核基因組結(jié)合在一起，創(chuàng)造新的雄性不育系，而且可以對 現(xiàn)有的不育細胞質(zhì)進行遺傳改造和修飾以除去某些不良特性。通過反義 RNA 技術(shù)阻斷與花粉發(fā)育有關(guān)的基因的表達用樣可以獲得雄性不育株。通過基因工程的方法擾亂線粒體與細胞核之間信息交流，可導致雄性不育。(5)克隆 PCR 產(chǎn)物 ,構(gòu)建差減文庫 。自 1999 年 Birch 等在對馬鈴薯晚疫病的研究中第一次將此技術(shù) 成功運用于植物領(lǐng)域后 ,近年來這一技術(shù)在植物方面的應用也取得了很大的進展 ,已將 SSH 方法應用到水稻、玉米、小麥、馬鈴薯、大豆、辣椒、胡蘿卜、大麥、棉花、康乃馨、擬南芥、甘蔗、甜菜、人參、芒果、灌。通過測序 ,除去重復序列共得到 175 個 Unique ESTs。它的催化活性僅僅決定于它的 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 。結(jié)果表明同核異質(zhì)但育性不同的 YTA 和 YTB 之間線粒體膜磷脂組分和脂肪酸配比存在明顯的差異 ,并且二者在外膜之間的差異明顯大于內(nèi)膜。葉片中生育前期不育系的游離脯氨酸含量和相應保持系之間基本上沒有大的差異 ,僅在生育后期存在一定的差異 ,但這些差 異變化無規(guī)律性。 朱廣廉等曾對顯性單基因控制的太谷核不育小麥不同發(fā)育階段的可育株和不育株的花藥及雌蕊內(nèi)游離脯氨酸和游離總氨基酸的含量進行了分析。關(guān)其原因可能是植株受到脅迫后 , 光合作用減弱 ( 從葉綠 素含量降低可以說明 ) , 棉葉合成的 Pro 減少 , 并導致了輸送到花藥的 Pro 降低。 100%不育株率的雄性不育材料最早是由本課題組于 1991 年在大白菜雄性不育“兩用系”輪配試驗中育成的，由于用傳統(tǒng)的單基因隱性或顯性遺傳無法解釋這種遺傳現(xiàn)象，從而提出了“大白菜核基因雄性不育復等位基因遺傳假說”（ Feng Hui et al., 1995），并為后來的實驗所證實（ Feng Hui et al., 1996）。 另外對 56 級的大花蕾有分別取萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊四份材料。沈陽農(nóng)業(yè)大學學士學位畢業(yè)論文 10 加入 200μl氯仿，劇烈震蕩 15sec，室溫放置 3 min。 4℃ 120xx rpm離心 2 min。分別提取 RNA（方法同 ） , 并采用 MMLV (PROMEGER)合成第一鏈 cDNA (參照說明書進行 )。最后，在 72℃ 保持 37min ，使產(chǎn)物延伸完整， 4℃ 保存。 F 可育花蕾； S 不育花蕾 BFAPG 基因 全長獲得 利用本課題組參與的“多國蕓薹屬植物基因組計劃項目”中大白菜 Chiifu 的 BAC 文庫與基因組測序結(jié)果信息資源，以 BFAPG 片段 所獲 得的全長序列如圖 5， 將全長序列與上述片段放入 NCBI 數(shù)據(jù)庫 blastn 進行雙序列比對（ Align two or more sequences），結(jié)果顯示全長序列中 287844 與原片段 100%同源，證明兩序列為同一基因。 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 沈陽農(nóng)業(yè)大學學士學位畢業(yè)論文 16 ACTIN ACTIN 圖 6 BFAPG 與 ACTIN 基因在不育及可育植株不同部位的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn) , ACTIN基因在所有的不育及可育植株的各等級花蕾中中均有相似表達，而目的基因 BFAPG僅在 雄蕊 中有表達， 而在花器官的其它部位均無表達 （圖 10） ，表明該基因為 雄蕊特異表達基因 。(2)在液氮中使樣品裂解完全 。通常分光光度計 A260 的 讀數(shù)要介于 之間才是可靠的，因 此 RNA 提取結(jié) 束后，要根據(jù)大概產(chǎn)量稀釋到適當濃度 范圍，再用分光光度計測量 。根據(jù)比對結(jié)果推斷此基因也可能與脯氨酸富集蛋白基因有關(guān)，朱廣廉等（ 1984）曾沈陽農(nóng)業(yè)大學學士學位畢業(yè)論文 18 對顯性單基因控制的太谷核不育小麥不同發(fā)育階段的可育株和不育株的花藥及雌蕊說明育性與脯氨酸的含量密切相關(guān)。 劉齊元（ 20xx）煙草游離脯氨酸含量與雄性不育性的關(guān)系結(jié)果表明 ,花蕾中不育系的脯氨酸含量在小花蕾階段與其保持系非常接近 ,但從中花蕾開始 ,保持系花蕾中的脯氨酸含量急劇上升 ,而不育系花蕾中的脯氨酸含量則基本保持穩(wěn)定 ,因而 ,不育系花蕾中的脯氨酸含量在大花蕾時期明顯低于其保持系 。 這將需 要進行更深入的研究。引種南方，南北各地均有栽培。目前， SSH 技術(shù)已開始應用于分離與次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)的基因。該技術(shù)在一個循環(huán)過程中完成差異表達基因豐度的均等化及目標群體和對照群體中相同基因的去除，從而實現(xiàn)差異表達基因的高度富集。 表明該基因為大白菜花蕾發(fā)育調(diào)控基因，它對育性控制發(fā)生在花蕾發(fā)生初期就已起作用 。本實驗結(jié)果與其基本一致。不同等級大小花蕾中的時序表達結(jié)果顯示，各等級可育花蕾中均有同等程度的表達，而在不育花蕾中均不表達。 BFAPG 基因 的功能預測 根據(jù)全長序列提交 (NCBI)數(shù)據(jù)庫 BLAST 進行序列相似性搜 索，得出此基因與擬南芥胞外脂肪酶有 95%的同源性，與蕓薹屬幾種作物的花粉專一性脯氨酸富集蛋白有 66%的同源性，與玉米花藥專一 性的脯氨酸富集蛋白有有 72%的同源性。(6)風干時，不要讓 RNA 顆 粒完全干燥，否則會大大降低它的溶解性 ?？?RNA 的濃度應達 到 ng／ μl，以 上為好，否則，合成的 dscDNA 產(chǎn)量低，達不到建庫的要求。結(jié)果發(fā)現(xiàn) , ACTIN基因在所有的不育及可育植株的 各等級花蕾中 中均有相似 表達，而目的基因 BFAPG僅在 各等級 可育花蕾中有表達， 且表達水平基本一致， 而在 不育花蕾中沒有表達 , 肉眼看不出有條帶產(chǎn)生 （圖 7） ，表明該基因為在一進入蕾期就開始起作用 。 acyltransferase/ carboxylesterase/ lipase (EXL6) mRNA, plete cds 95% 1 NM_001084 Arabidopsis thaliana family II extracellular lipase 5 (EXL5) (AT1G75920) mRNA, plete cds 96% 1 NM_106241.3 Arabidopsis thaliana EXL4。（如圖 1） F1 F6 S1 S6 沈陽農(nóng)業(yè)大學學士學位畢業(yè)論文 13 圖 1 甲型兩用系 ‘AB01’ 不同等級花蕾 RNA電泳圖 F1F6 可育花蕾 6個級別； S1S6 不育花蕾 6個級別 肉桂酸轉(zhuǎn)移酶基因 BFAPG 片段的獲得 按照 Clontech 公司的 PCRSelectTM cDNA Subtraction Kit 說明書，經(jīng) 抑制差減雜交及M13 通用引物 PCR 驗證獲得一片段大小約 600bp 的 條帶 （圖 2） ， 將該克隆送往上海生工進行測序，去除載體和接頭序列后得到該片段的序列（圖 3） ： 圖 2 抑制差減文庫獲得 BFSKS 克隆的 PCR 檢測結(jié)果 圖 3 BFSKS 基因片段的測序結(jié)果 BFAPG 差異表達片段 RTPCR 驗證 以 不育 花蕾 與可育花蕾 （均為不同等級大小的花蕾等量混合） 為材料 進行研究 , 采用 RTPCR方法調(diào)查了 BFAPG基因的表達差異變化。 PCR 反應體系： 組分 Components 反應體系 Reaction system Template cDNA 5μl 10Buffer 3μl dNTP Mixture 引物 上游 1μl 引物 下 游 1μl U 目的片段獲得方法 將提取的 RNA采用 MicroFast Track 試劑盒 (Invitrogen)提供的試劑進行 mRNA的純化，并按試劑盒推薦方法進行操作。向吸附柱 CR3 加入 500μl去蛋白液 RD， 4℃ 120xx rpm 離心30 sec，棄廢液。L1 NaAc，高壓滅菌。 1 材料和方法 1 材料和方法 實 驗材料 本研究所用材料為本課題組轉(zhuǎn)育的大白菜雄性不 育甲型兩 用系 “AB01 ”，不育與可育材料除育性外背景相同，是研究差異基因分離的理想材料。雄性不育系的利用是配制大白菜雜交種經(jīng)濟、可靠的制種手段 (孫日飛， 20xx)。（ 4）關(guān)于游離總氨 基酸的含量 , 在花藥中減數(shù)分裂期 , 不同育性植株之間無明顯差異；在小孢子單核初期 , 可育株高于不育株。 Amr Ageez 等（ 20xx）在研究 叉枝蠅子草 雄性不育雄性不育相關(guān)基因表達時分離到了 APG 基因，并將其命名為 SIAPG, 表明 SIAPG僅在花藥中表達，在雌蕊中不表達。對于線粒體總膜磷脂中含量最高的脂肪酸組分 18C:0 在不育系 YTA 中的含量極顯著高于同核異質(zhì)的 YTB,而多不飽和脂肪酸 (N:2 和 N:3)含量和 IUFA 則是 YTB 極顯著高于 YTA。植物中含脂肪酶較多的是油料作物的種子，如蓖麻籽、油菜籽，當油料種子發(fā)芽時，脂肪酶能與其他的酶協(xié)同發(fā)揮作用催化分解油脂類物質(zhì)生成糖類，提供種子生根發(fā)芽所必需的養(yǎng)料和能量； 4 脂肪酸代謝與雄性不育 生物體內(nèi)脂肪是由脂肪酶水解，在脂肪酶的催化下生成 一分子甘油和三分子脂肪酸，脂肪酶的特點：主要作用于有酯鍵的化合物，不論脂肪來源于什么組織，不論脂肪酸碳鏈的長短，只要是酯鍵，脂肪酶就可以使其斷裂，這就是酶的專一性即鍵專一性。辣椒 CMS 類型已鑒定出有關(guān)的線粒體基因 (Kim etal,20xx),但相關(guān)的核育性恢復基因的分離克隆研究較少劉忠松 等 ,20xx,從辣椒 CMS 育性恢復相關(guān)基因入手 ,利用SSH技術(shù)分離辣椒 CMS育性恢復相關(guān) ESTs,構(gòu)建辣椒 CM S育性恢復相關(guān) cDNA 文庫 ,為進一步對辣椒育性恢復相關(guān)基因進行深入研究奠定基礎(chǔ)。對序列進行 BLAST 比對及功能注釋 ,cDNA 文庫的基因表達譜 ,發(fā)現(xiàn)在可育 cDNA 文庫中參與能量代謝的基因出現(xiàn)頻率較高 ,在不育 cDNA 文庫中檢測到了與花發(fā)育調(diào)控相關(guān)的 MADSbox 轉(zhuǎn)錄因子、細胞凋亡相關(guān)的泛素結(jié)合酶及阻遏淀粉合成的腺苷二磷酸葡萄糖磷酸化酶等相關(guān)基因。提取 tester RNA 的時期非常關(guān)鍵 ,選擇使用該方法時 ,首先要根據(jù)不同的研究目的確