【正文】 完成人姓名 史 秀 舉 專業(yè) 園 藝 指導教師姓名 冀 瑞 琴 職稱 副 教 授 本畢業(yè)論文（設計）的創(chuàng)新點： 題在研究方法上較新穎，差減文庫在水稻中研究較多，目前在大白菜上研究的還比較少，本人通過對不育系和可育系兩個品種的分析試驗，并對其進行相關性分析 ,以明確差減文庫在雄性不育上的應用。十九世紀傳入日本、歐美各國。一個典型的 SSH 過程，可在一個差減雜交過程中將稀有基因序列富集上千倍。 SSH 技術。首先， SSH 技術廣泛應用在分離植物發(fā)育過程中不同發(fā)育階段和不同組織器官中的組織特異性表達的基因，為揭示植物生長發(fā)育過程的分子機理提供了有效手段；另外，在不同植物中，該技術被大量應用于分離各種生物及非生物脅迫條件下誘導表達的抗性相關基因，可以揭示植物抗逆的分子機理。 抑制性差減雜交技術 (SSH)是基于抑制 PCR 作用的 cDNA 差減雜交，是在轉錄水平上研究差異基因表達的技術。 完成人簽名： 指導教師簽名： 20xx 年 6 月 2 日 20xx 年 6 月 15 日 文 獻 綜 述 題 目： 大白菜核基因雄性不育抑制差減文庫構建 抑制性差減雜交 (SSH)技術及其在大白菜轉育上的應用 摘要 : 白菜原產(chǎn)于我國北方，俗稱大白菜?？捎ɡ僦?花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊只在雄蕊中表達，而在其他花器官組織中均不表達。 TBLASTX 比對結果顯示該基因屬于 花粉囊專一性的脯氨酸富集蛋白 基因 也可能屬于 脂肪酶 基因 。葉片中游離脯氨酸含量與煙草雄性不育性沒有直接關系。說明此基因跟雄蕊的生長 發(fā)育 有關。 BFAPG 基因 的功能部位 BFAPG 基因在須根、根、莖、葉、蕾中的 RTPCR 時序表達結果顯示，該基因除在可育花蕾中表達外，可育植株的其它部位及不育植株中均沒有表達。其柱頭頂端電鏡觀察豁絨層完好，可正常授粉。 表現(xiàn)為 28S 與 18S 亮度接近 2： 1，OD260/OD280 在 之間（如圖 1）。 RNA 通常用分光光度計定量，測量在 260nm 處的吸收值 （ A260） 。(5)用足量 75%的乙醇洗滌RNA。 要想獲得理想的 RNA 產(chǎn)量 和純度，除防 止 RNase 污染外，還應注意以下幾點 :(l)取下的樣品應立即處理或冷凍 。 13：花萼的 3 個重復 ； 46：花瓣的 3 個重復； 79：雄蕊的 3 個重復；1012：雌蕊的 3 個重復 討論 RNA 提取 保證 RNA 的產(chǎn)量和純度及措施對于構建 cDNA 文庫，模 板 RNA 的質量直接影響到 cDNA 合成的效率，分離純 化 RNA 的關鍵在于消除 RNase 對 RNA 的 降解，提高 RNA的 產(chǎn)量純度。 16 分別為可育植株的 16 級 花蕾； 712 分別為不育植株 的 16 級 花蕾 BFAPG 基因 在花器官的表達分析 分別取 可育 植株 的花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊 為材料進行研究 , 采用 RTPCR方法調查了 BFAPG基因的表達差異變化 ，重復 3次 。 BFAPG 基因 在 不同等級 花蕾中 時序表達 分別取 不育與可育 植株的不同大小等級花蕾 為材料進行研究 , 采用 RTPCR方法調查了 BFAPG基因的表達差異變化。而目的基因 BFAPG僅在可育花蕾中有較高水平的 表達，而在可育植株的其它部位及 不育花蕾中 均 沒有表達 , 肉眼看不出有條帶產(chǎn)生 （圖 6） ，表明該基因為可育花蕾特異表達基因 。 沈陽農(nóng)業(yè)大學學士學位畢業(yè)論文 15 表 3 BFAPG基因全長序列 TBLASTX比對結果 Accession Description Query coverage E value N Links NM_106243.3 Arabidopsis thaliana EXL6。 F S ACTIN 412bp BFAPG 376bp 1 G T AC CC G CC T A TCG CA G G TT G CG C CG C A TC AA G CC CG A CG AC CT T AA AA C 5 1 TG G CG TTTG T TTCG CA TCA G G TG G TTCA G G AA TTG AC CA T CT T AC A TCC A 1 0 1 G AA CA CTG G G AG TT TTG TCC AC AG G CG AC C AA A T A G G AG A TTTC AA AA AA 1 5 1 T A TTTG AA G A AA T T A AA G AA TG CG AC G AA A A A T AA G AA A G AA A T G AA AA A 2 0 1 AA T AA T TTCA AA CG C AG TG T TTCT T A TTT C TG AA G G AA A T AA CG A T A TT G 2 5 1 G A T AC TTC G T G AC T CC CG CT CG TC T AC G A T T A CG A TCC A T AG A T AC A T A C 3 0 1 AC AA G TG AC A TG G T TTTTTG G AC AA AA G CA TT CC T AC AA G A TT T A T A T G A 3 5 1 TCTT G G AG C G AG AA AA TTC G CG G T G A TG G G A G TG A TTCC G G T AG G A TG CT 4 0 1 TG CC CTTC CA TCG C TT CC T A TTTG G TG G AG T A TTCG CA T G G TG T AA CTT C 4 5 1 A TG A TG AA T A G A A TT TCG G A AG AC TT CA AC AC A AA A TT AC AG AA A G CTC T 5 0 1 T A TTG G T T AC G A AG T AG AA A AA A G TTTT AA AG G TG CA AA G TTTG TTT A CG 5 5 1 TCG AC A TG 沈陽農(nóng)業(yè)大學學士學位畢業(yè)論文 14 圖 4 BFAPG 基因在可育、不育花蕾中的表達 。并分別提取 RNA， RNA提取采用 TIANGEN公司 RNA simple Total RNA Kit 進行，所提 RNA 質量合格，表現(xiàn)為 28S 與 18S 亮度接近 2： 1， OD260/OD280在 之間。重復這樣的循環(huán) 27 次，使擴增的 DNA 片段大量累積。 以不育花蕾和可育花蕾的第一鏈 cDNA 為模板 ,在線性擴增期進行半定量 PCR, 相關參數(shù)見表 2。 RTPCR 以可育株與不育株花蕾為材料，重復三次，每重復為 10 棵植株的混合花蕾。cm1，電泳 1520 min 后，凝膠成像儀照相分析。將吸附柱 CR3 放入 2 ml管中，加入 50μl RNasefree ddH2O，室溫放置 2 min。 4℃ 120xx rpm離心 30 sec，棄廢液。 2 總 RNA 提取及質量檢測分析 使 用 RNA simple Total RNA Kit（ TIANGEN 公司，離心柱型）進行總 RNA 提取 ，參照說明書，具體步驟如下： 取 樣品，液氮研磨后迅速加入 1ml裂解液 RZ，漩渦 1min，室溫放置 5min。 用 % DEPC 水配 制 75 %乙 醇、 5 mol 我們按照花藥在可育 、 不育花蕾中的發(fā)育變化情況 ， 初步 將花蕾 分為 6 個等級，即 1 級（花蕾長度＜ mm），穩(wěn)定發(fā)育期； 2 級（花蕾長度： ～ 2mm），不育初期； 3 級（花蕾長度 : 2～ ）， 4級（花蕾長度 : ～ 3 mm）， 5 級（花蕾長度 : 3～ ）， 6 級（花蕾長度＞ mm） ， 分別選取開花期一致、其它性狀相同的不育和可育材料的未開放花蕾按上述標準分別分為6 個等級。本研究即對大白菜育性相關 花粉囊專一性的脯氨酸富集蛋白 基因 BFAPG 的功能及時序表達作了相應研究，為探索復等位基因遺傳的大白菜核雄性不育的機理奠定了基礎。 沈陽農(nóng)業(yè)大學學士學位畢業(yè)論文 9 理想雄性不育系的不育株率應為 100%，經(jīng)濟性狀具有較高的配合力。由于其花器官小，單花結籽少，而單位面積的播種量又較大，常規(guī)的雜交制種必然存在去雄費工、費力、成本高等缺點。 王強等（ 20xx）采用化學殺雄劑以及增加脯氨酸的去雄劑對棉花花藥氨基酸的影響，得出化學殺雄劑引起的氨基酸代謝失調可能是造成雄性不育的主要原因之一。（ 3）在雌蕊中 , 游離脯氨酸的含量遠遠低于花藥 , 不同育性植株之間差異不很明顯。 一般認為 , 花藥中游離氨基酸含量 , 尤其是游離脯氨酸含量與花粉育性 有密切關系。 5. 花粉囊專一性的脯氨酸富集蛋白（ antherspecific prolinerich protein， APG） 的功能 花粉囊專一性的脯氨酸富集蛋白（ antherspecific prolinerich protein， APG） Roberts等人（ 1993）發(fā)現(xiàn) antherspecific prolinerich protein， APG 表現(xiàn)于在阿拉伯芥菜 Brssica napus 的花藥中，他們以 APG promoter 啟動基因并轉植到 中表現(xiàn)，結果發(fā)現(xiàn)該基因在許多不同種類花朵細胞中持續(xù)表達。 劉齊元（ 20xx）煙草游離脯氨酸含量與雄性不育性的關系結果表明 ,花蕾中不育系的脯氨酸含量在小花蕾階段與其保持系非常接近 ,但從中花蕾開始 ,保持系花蕾中的脯氨酸含量急劇上升 ,而不育系花蕾中的脯氨酸含量則基本保持穩(wěn)定 ,因而 ,不育系花蕾中的脯氨酸含量在大花蕾時期明顯低于其保持系 。相對于內膜 ,外膜的膜磷脂含量在 YTA 與同核異質的 YTB 間差異更大 ,尤其是 PE、 PA 和 PC 的含量。 分別用 HPLC 和 GC 分析了紅蓮型細胞質雄性不育水稻同核異質系 YTA 和 YTB 線粒體總膜、內膜以及外膜磷脂類型和脂肪酸的各組分 ,并用面積歸一化法定量分析了各種膜磷脂組分和脂肪酸的含量配比。脂肪酶廣泛的存在于動植物和 微生物 中。 脂肪酶基本組成單位僅為 氨基酸 ，通常只有一條多肽鏈。按照 MIPS 功能分類法 ,將其分為 14 個功能組 ,涉及代謝、脅迫應答、蛋白活性、轉錄因子、信號轉導等多方面的功能。結合高密度點陣膜雜交差 異篩選 ,獲得了 282 個陽性克隆。在不育和可育 cDNA 文庫中隨機挑選 120 個陽性克隆進行測序 ,獲得 100余條高質量的表達序列標簽 (EST)。 沈陽農(nóng)業(yè)大學學士學位畢業(yè)論文 6 SSH 技術自 1996 年提出以來 ,在動物研究領域中 ,已成功地應用到許多分子遺傳學和基因克隆的研究中 ,如鑒別病理變化、生物體生長發(fā) 育、組織分化中的基因表達變化以及其他差別表達的基因。 缺點： SSH 方法一般只用于兩個樣品的差異比較分析 ,樣品間的差異不宜太大或太小 ,而對于多個樣品則無能為力 ,這在很大程度上限制了它的應用。(4)選擇性 PCR 擴增與接頭相連的試驗組 cDNA 分子 。同時 ,由于試驗組的 cDNA 在進行雜交之前等分的兩份加有不同的接頭 ,因此雜交時將產(chǎn)生 5 種不同類型的分子 a、 b、 c、 d 和 e(圖 1),當采用與兩個不同接頭序列互補的引物進行 PCR 擴增時 ,只有目標序列得到有效擴增 ,非目標序列因兩端存在反向重復序列 ,退火時易產(chǎn)生類似”鍋柄”的結構 ,無法與引物配對 ,擴增受到抑制。 (6)隨著分子水平的研究不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)細 胞質雄性不育與線粒體基因有密切沈陽農(nóng)業(yè)大學學士學位畢業(yè)論文 5 關，現(xiàn)在已在玉米、矮牽牛、油菜等線粒體 DNA 上找到了與 CMS 有關的基因。絨氈層中的合成與分泌的特異性對于花粉的正常發(fā)育具有決定性作用。花粉發(fā)育是一個及其復雜的過程，許多基因與花粉發(fā)育有關。 6） 基因工程 目前利用基因工程創(chuàng)造雄性核不育的策略主要是利用花粉發(fā)育的特異啟動子與外源基因嵌合，構建表達載體，轉化植物來阻斷花粉發(fā)育的過程從而達到雄性不育的目的。因而體細胞雜交為研究雙親細胞器的互作提供了新手段，這種雜種稱作細胞質雜種（ Cybrid）。 4） 基因轉育 已經(jīng)發(fā)現(xiàn) 的雄性不育基因，可以通過連續(xù)回交和反復選擇的方法轉育到農(nóng)藝性狀優(yōu)良的其它基因型作物上。約 74%核質互作雄性不育來自種間或屬間雜種的后代。 植物雄性不育性的來源 1） 自然突變 雄性不育性的自發(fā)產(chǎn)生是由于細胞核基因或細胞質基因或兩者的自然突變。當細胞