【正文】 RNA配基 (aptamer)已經(jīng)獲得美國(guó) FDA批準(zhǔn)上市，商品名為 Macugen，用于老年性視網(wǎng)膜黃斑營(yíng)養(yǎng)不良 (AMD)的治療。 RNA 干擾技術(shù) 早在 1990 年，人們就發(fā)現(xiàn)植物中存在轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。 1995 年，康乃爾大學(xué)的 Guo在利用反義 RNA技術(shù)特異性地抑制秀麗新小桿線蟲 (C. elegans)中的 par1基因的表達(dá)時(shí)，意外發(fā)現(xiàn)對(duì)照實(shí)驗(yàn)中給線蟲注射正義 RNA(sense RNA)也能抑制 par1 基因的表達(dá)。 直到 1998 年， Fire 和 Mello才首次揭示雙鏈 RNA能夠特異抑制具有相同序列的靶 mRNA 的表達(dá)，并將這一現(xiàn)象稱為 RNA 干涉(RNA interference， RNAi)。 在隨后的短短一年中， RNAi 現(xiàn)象被廣泛地發(fā)現(xiàn)存在于大多數(shù)真核生物中， RNAi 技術(shù)也被迅速應(yīng)用到生命研究的各個(gè)領(lǐng)域。 目前， RNAi 技術(shù)作為基因功能研究和疾病基因治療的革命性工具，已經(jīng)在醫(yī)藥開發(fā)、基因治療和功能基因組研究等方面得到廣泛應(yīng)用，并于 2023 年獲得諾貝爾獎(jiǎng)。 RNAi 技術(shù)的作用基礎(chǔ)是 siRNA 的基因沉默作用。 RNA干擾 一些小的雙鏈 RNA可以高效 、 特異地阻斷體內(nèi)特定基因表達(dá) ,促使ｍ RNA降解 ,誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型 ,稱為 RNA干擾 (RNA interference, RNAi,也譯作 RNA干預(yù)或者干涉 )。 RNA干擾原理 RNAi－一種新的遺傳學(xué)研究工具 ? RNAi是植物、果蠅、線蟲和很可能包括哺乳動(dòng)物在內(nèi)的許多生物 抵抗病毒感染 和 限制轉(zhuǎn)座子運(yùn)動(dòng) 的一種自然存在的防御機(jī)制。 ? RNAi可以作為一種簡(jiǎn)單、有效的 代替基因敲除 的遺傳工具，來(lái)制備特定基因缺失表型的個(gè)體 , 從而研究該基因的功能 .它正在 功能基因組學(xué) 領(lǐng)域掀起一場(chǎng)真正的革命 ,并將徹底改變這個(gè)領(lǐng)域的研究步伐 ,為此被 SCIENCE評(píng)為 2023年最重要的科研成果之一。 ? 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中用 siRNA (21－ 23核苷酸長(zhǎng)的小分子干擾ＲＮＡ片段 (small interfering RNAs,siRNAs,又被稱為引導(dǎo) RNAs)。能高效阻斷某個(gè)特定基因的表達(dá) ,這項(xiàng)技術(shù)在疾病的 基因治療 上也有光明的應(yīng)用前景。特別可以用于阻斷某些突變基因的表達(dá) ,或者由蛋白過量表達(dá)引起的疾病。 共抑制現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn) ＲＮＡｉ研究的早期線索早在 20年前 ,來(lái)自于 美國(guó)和荷蘭的兩個(gè)轉(zhuǎn)基因植物實(shí)驗(yàn)組 Richjensen和同事 ,在對(duì) 矮牽牛 (petunias)進(jìn)行的研究中有個(gè)奇怪的發(fā)現(xiàn) :將一個(gè)能 產(chǎn)生色素的基因 置于一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子后 ,導(dǎo)入矮腳牽牛中 ,試圖加深花朵的紫顏色 ,結(jié)果沒看到期待中的深紫色花朵 ,多數(shù)花成了花斑的甚至白的 。 jensen將這種現(xiàn)象命名為 共抑制 (cosuppression),因?yàn)閷?dǎo)入的基因和其相似的內(nèi)源基因同時(shí)都被抑制 。 開始這被認(rèn)為是矮牽牛特有的怪現(xiàn)象 ,后來(lái)發(fā)現(xiàn)在其他許多植物中 ,甚至在真菌中也有類似的現(xiàn)象 。 基因沉默 ? 轉(zhuǎn)錄階段基因沉默 (transcriptional gene silencing ,or TGS)： 對(duì)于部分植物來(lái)說(shuō) ,轉(zhuǎn)基因引發(fā)的基因沉默可能是因?yàn)榛蛱禺惖募谆鴮?dǎo)致 ,這被稱為轉(zhuǎn)錄階段基因沉默 . ? 轉(zhuǎn)錄后發(fā)生的基因沉默 (post transcriptional gene silencing ,or PTGS)： Ｈａｍｉｌｔｏｎ等 ,率先在發(fā)生ＰＴＧＳ的西紅柿中檢測(cè)出與被沉默基因同源的約 25ｎｔ的短片段ＲＮＡ ,而未發(fā)生ＰＴＧＳ的西紅柿則不能檢出 25ｎｔ的ＲＮＡ ＨａｍｉｌｔｏｎＡＪｅｔａｌ . Ｓｃｉｅｎｃｅ ,1999,286(5441):950— 952 目前在體內(nèi)或體外 RNAi 中應(yīng)用的 siRNA 主要有兩種來(lái)源：體外化學(xué)合成或轉(zhuǎn)錄的 siRNA和利用 DNA載體在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生。 由化學(xué)合成或體外轉(zhuǎn)錄的方法得到 ~21nt 的siRNA，目前應(yīng)用得最廣泛。尤其是經(jīng)過修飾后提高穩(wěn)定性的 siRNA仍可表現(xiàn)特異的基因沉默作用，為其在體內(nèi)的應(yīng)用提供了可能的前景，而且目前的研究表明，無(wú)論在細(xì)胞或動(dòng)物體內(nèi)，應(yīng)用此類 siRNA 均不影響體內(nèi) miRNA 的表達(dá)和功能，進(jìn)一步說(shuō)明 siRNA 應(yīng)用的可靠性。 也有根據(jù)靶基因 mRNA設(shè)計(jì)的長(zhǎng) dsRNA經(jīng) Dicer 剪切成一系列 ~21nt 的 siRNA(統(tǒng)稱為 esiRNA)，能更有效、更方便地抑制基因的表達(dá)，但是其缺點(diǎn)是可能存在非特異效應(yīng)。 隨著 miRNA研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)根據(jù) miRNA設(shè)計(jì)的發(fā)夾 RNA，或基于 siRNA的發(fā)夾 RNA 在體內(nèi)都表現(xiàn)出有效地基因抑制作用。 基于 DNA 載體在體內(nèi)表達(dá) siRNA 的技術(shù)，其優(yōu)勢(shì)是可調(diào)控的表達(dá)，而且利用病毒載體可能更易在體內(nèi)獲得應(yīng)用；但是這種系統(tǒng)不可避免的與 miRNA機(jī)制相競(jìng)爭(zhēng)，從而導(dǎo)致相當(dāng)大的非特異性和毒性。 RNAi 技術(shù)的問題 盡管 RNAi 技術(shù)飛速發(fā)展，它的應(yīng)用也開始向高通量的方向發(fā)展，但是在機(jī)制研究和應(yīng)用方面還存在著許多問題。 其一是 s i RNA 存在一種稱為“ offtarget”的作用，導(dǎo)致相當(dāng)?shù)?非特異效應(yīng) 。也許今后針對(duì)體內(nèi)天然存在的具有 RNA干擾作用的 miRNA，設(shè)計(jì)特異調(diào)節(jié)該 miRNA表達(dá)水平的藥物是避免“ offtarget”作用的最佳選擇。 其二是遞送系統(tǒng)的限制，如何找到一種高效而低毒的用于人體的 轉(zhuǎn)運(yùn)載體 是擺在所有核酸類藥物應(yīng)用面前的最大難題。目前 siRNA藥物在人體的應(yīng)用主要還是集中在眼睛和肝等核酸類藥物相對(duì)易達(dá)到的部位。 最近，有研究表明，通過與一些組織或細(xì)胞特異分子(如多肽、 aptamer 等 )聯(lián)用的修飾 siRNA 分子，可以使siRNA分子較有效地穿過細(xì)胞膜，甚至穿越血腦屏障，為該類藥物的實(shí)際應(yīng)用帶來(lái)了希望。 另外，各種導(dǎo)入方法的應(yīng)用和改進(jìn)，例如直接注射法、尾靜脈水動(dòng)力注射法等，也取得較好效果，但是距離真正用于臨床還有相當(dāng)長(zhǎng)的路要走。 第三節(jié) 與 RNA相關(guān)的生物信息學(xué)技術(shù) 與 RNA相關(guān)的生物信息學(xué)技術(shù) 隨著生物信息學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，與 RNA 研究相關(guān)的各種數(shù)據(jù)庫(kù)、 RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、非編碼 RNA基因預(yù)測(cè)、 siRNA設(shè)計(jì)等生物信息學(xué)技術(shù)也逐漸完善。 1 數(shù)據(jù)的整合與挖掘技術(shù) 隨著 RNA 研究的進(jìn)步，有關(guān) RNA 的各種數(shù)據(jù)也在快速增加，例如各種表達(dá)譜數(shù)據(jù)、各類非編碼 RNA 序列信息、 RNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)、各種研究工具和技術(shù)方法等。 相關(guān)的 RNA 數(shù)據(jù)整合與挖掘?yàn)檠芯空咛峁┝肆己玫闹С帧? 值得關(guān)注兩個(gè) RNA 領(lǐng)域的重要網(wǎng)站： 英國(guó)的 Rfam網(wǎng)站； 德國(guó)的“ The RNA World website”網(wǎng)站 。 （它們均提供各種數(shù)據(jù)庫(kù)和網(wǎng)上工具） 2 非編碼 RNA 基因的預(yù)測(cè)技術(shù) 目前的研究表明，大多數(shù)的轉(zhuǎn)錄本并不編碼蛋白質(zhì)， 這些非編碼RNA在生命過程中有著重要作用 。尋找和驗(yàn)證這些非編碼 RNA是一個(gè)非常艱巨的工作，其中生物信息學(xué)預(yù)測(cè)是一個(gè)不可替代的有力工具。 通過對(duì)已知非編碼 RNA基因的分析，統(tǒng)計(jì)歸納出一定地規(guī)律，是這些技術(shù)的常用手段。 目前多種非編碼轉(zhuǎn)錄本的預(yù)測(cè)方法都有報(bào)道，如 tRNA 的預(yù)測(cè) 、snoRNA 的預(yù)測(cè) 、 microRNA 的預(yù)測(cè) 、 piRNA 的預(yù)測(cè) 等等，只是準(zhǔn)確率還有待于進(jìn)一步提高。 3 RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) RNA 功能的實(shí)現(xiàn)與其具有一定的空間結(jié)構(gòu)是分不開的，這正是 RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的意義所在。 RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)常用的兩種方案是 Zuker 的 最小自由能預(yù)測(cè) 方法和基于 螺旋區(qū)堆積 的方法， 常用軟件有 Mfold和 Vienna RNA package。 4 microRNA靶基因預(yù)測(cè)技術(shù) microRNA表現(xiàn)出越來(lái)越重要的基因表達(dá)調(diào)控功能，成為 RNA研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。然而其靶基因的實(shí)驗(yàn)確定目前還非常困難， 通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)是確定 microRNA 靶基因的重要手段。 目前常用軟件有： rna2 TargetScans、 Pictar、 miRanda 等等。 RNA 應(yīng)用中的設(shè)計(jì)工具在反義核酸、核酶以及 siRNA 應(yīng)用中，需要遵循一定的規(guī)律，從而形成相關(guān)的設(shè)計(jì)原則。 目前人們已經(jīng)根據(jù)大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和經(jīng)驗(yàn)建立了多種比較成熟的設(shè)計(jì)軟件和工具，極大地促進(jìn)了這些核酸的有效利用，豐富了生物信息學(xué)的內(nèi)容。 結(jié)語(yǔ) RNA 研究的進(jìn)步離不開 RNA 技術(shù)的發(fā)展 一般地講，新的理化技術(shù)的引進(jìn)，可以使得 RNA 技術(shù)和 RNA 的研究產(chǎn)生革命性進(jìn)步；然而，更多的是在已有技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過 改變思路 和 技術(shù)整合 ，使已有的 RNA 技術(shù)得到進(jìn)一步改良。 RNA 技術(shù)不是孤立的，它與其他生物、化學(xué)、物理技術(shù)相互交叉。 RNA 技術(shù)的研究是 RNA 組學(xué)重要內(nèi)容之一。隨著RNA組學(xué)研究的不斷深入，新的 RNA 技術(shù)也將不斷出現(xiàn)，并對(duì) RNA 的研究、生命本質(zhì)的認(rèn)識(shí)和疾病的防治提供巨大幫助。 謝謝！ 謝謝觀看 /歡迎下載 BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES. 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