【正文】 A、 U， C)當(dāng)三聯(lián)碼為 GUC時(shí)，被水解的活性最高。 理論上講，一個(gè) 40個(gè)堿基的隨機(jī)序列可有 X 1024種核苷酸排列順序 (440 = X 1024)。 RNA 干擾技術(shù) 早在 1990 年，人們就發(fā)現(xiàn)植物中存在轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。 ? RNAi可以作為一種簡(jiǎn)單、有效的 代替基因敲除 的遺傳工具，來(lái)制備特定基因缺失表型的個(gè)體 , 從而研究該基因的功能 .它正在 功能基因組學(xué) 領(lǐng)域掀起一場(chǎng)真正的革命 ,并將徹底改變這個(gè)領(lǐng)域的研究步伐 ,為此被 SCIENCE評(píng)為 2023年最重要的科研成果之一。 由化學(xué)合成或體外轉(zhuǎn)錄的方法得到 ~21nt 的siRNA，目前應(yīng)用得最廣泛。 其二是遞送系統(tǒng)的限制，如何找到一種高效而低毒的用于人體的 轉(zhuǎn)運(yùn)載體 是擺在所有核酸類(lèi)藥物應(yīng)用面前的最大難題。 （它們均提供各種數(shù)據(jù)庫(kù)和網(wǎng)上工具） 2 非編碼 RNA 基因的預(yù)測(cè)技術(shù) 目前的研究表明，大多數(shù)的轉(zhuǎn)錄本并不編碼蛋白質(zhì)， 這些非編碼RNA在生命過(guò)程中有著重要作用 。 目前常用軟件有： rna2 TargetScans、 Pictar、 miRanda 等等。隨著RNA組學(xué)研究的不斷深入，新的 RNA 技術(shù)也將不斷出現(xiàn)，并對(duì) RNA 的研究、生命本質(zhì)的認(rèn)識(shí)和疾病的防治提供巨大幫助。 4 microRNA靶基因預(yù)測(cè)技術(shù) microRNA表現(xiàn)出越來(lái)越重要的基因表達(dá)調(diào)控功能，成為 RNA研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。 相關(guān)的 RNA 數(shù)據(jù)整合與挖掘?yàn)檠芯空咛峁┝肆己玫闹С帧? 其一是 s i RNA 存在一種稱(chēng)為“ offtarget”的作用，導(dǎo)致相當(dāng)?shù)?非特異效應(yīng) 。 開(kāi)始這被認(rèn)為是矮牽牛特有的怪現(xiàn)象 ,后來(lái)發(fā)現(xiàn)在其他許多植物中 ,甚至在真菌中也有類(lèi)似的現(xiàn)象 。 RNA干擾 一些小的雙鏈 RNA可以高效 、 特異地阻斷體內(nèi)特定基因表達(dá) ,促使ｍ RNA降解 ,誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型 ,稱(chēng)為 RNA干擾 (RNA interference, RNAi,也譯作 RNA干預(yù)或者干涉 )。 SELEX 技術(shù)改良 經(jīng)過(guò) 15年的發(fā)展， SELEX 技術(shù)不斷得到改進(jìn)與完善，實(shí)現(xiàn)了篩選流程的自動(dòng)化、篩選形式的多樣化、篩選結(jié)果的快速化， aptamer 也有了多種應(yīng)用形式。 原理 從大量的隨機(jī)序列的寡核苷酸庫(kù)中鑒定出一種數(shù)量很少的具有獨(dú)特性質(zhì)的核酸序列的方法是由 Tuerk和 Ellington等在 1990年建立的，它是一種通過(guò) 體外反復(fù)選擇和放大 從巨大的核苷酸組合庫(kù)中篩選特定核苷酸序列的方法。 RNA底物通過(guò)二個(gè)莖環(huán)結(jié)合到核酶上，切割位點(diǎn)由一個(gè)非配對(duì)堿基及與之相連的二個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)組成。 核酶通過(guò)催化轉(zhuǎn)磷酸酯和磷酸二酯鍵水解反應(yīng)參與RNA自身剪切、加工過(guò)程。 1984 年， Izant 和 Weintraub 等首次提出反義核酸技術(shù)(antisense technology)的概念。） 其他 RNA研究相關(guān)技術(shù) 在 RNA的研究中不可避免的會(huì)遇到 RNA降解問(wèn)題，這就需要利用 RNA保存技術(shù) ，這是 RNA研究中最基礎(chǔ)也是最重要的技術(shù)之一。 二是利用各種文庫(kù)篩選技術(shù)，如酵母三雜交技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、核糖體展示技術(shù)、抑制細(xì)菌轉(zhuǎn)錄終止檢測(cè)技術(shù)、 Northwestern 技術(shù)等篩選 RNA結(jié)合蛋白。 小 RNA的克隆和鑒定 小鼠腦 組織勻漿 總 RNA 8%PAGE 回收 50110nt(fractionI)和 110500nt(fractionII) Poly(A)聚合酶加 C尾 cDNA pSPORT1 PCR 高密度陣列 雜交除去高豐度、已知的小 RNA 未雜交的 cDNA測(cè)序 詳見(jiàn)： 蛋白質(zhì) RNA復(fù)合物分離法 分離蛋白質(zhì) RNA復(fù)合物，除去蛋白質(zhì)，純化 RNA分子，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，克隆，測(cè)序，結(jié)果分析。 近年來(lái)發(fā)展的 CAGE(cap analysis gene expression)，SAGE(serial analysis of gene expression)等技術(shù)可以實(shí)現(xiàn) RNA 末端大規(guī)模鑒定。（ DEPC二乙基焦碳酸酯為活性很強(qiáng)的劇毒物，須在通風(fēng)櫥中小心使用） 將待處理的塑料制品放入一個(gè)可以高溫滅菌的容器中，注入DEPCH2O，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中，在通風(fēng)柜中37℃ 或室溫下處理過(guò)夜 將 DEPCH2O小心倒入廢液瓶中，將裝有 DEPCH2O處理過(guò)的塑料制品的容器以鋁箔封口，高溫高壓蒸汽滅菌至少 30分鐘。細(xì)胞裂解之后要看不見(jiàn)顆粒狀物質(zhì)（結(jié)締組織和骨除外）。 RNA可利用體外轉(zhuǎn)錄體系合成 利用 體外轉(zhuǎn)錄體系 （ in vitro transcription system） 合成RNA是分子生物學(xué)常用技術(shù) 。 RNA應(yīng)用相關(guān)技術(shù)則包括用于生產(chǎn)其他產(chǎn)品的 RNA技術(shù)和直接用于藥物開(kāi)發(fā)的 RNA技術(shù) 。 ? 1986年， Walter Gilbert 創(chuàng)造了“ RNA world”這個(gè)名詞，用于描述其提出的關(guān)于分子起源的假說(shuō)：在生命進(jìn)化的早期存在一個(gè)只有 RNA，沒(méi)有 DNA和蛋白質(zhì)的世界； RNA既是遺傳信息載體又具有酶的催化功能，它們催化自身的合成。 ? 疾病 → 機(jī)體病理生理過(guò)程變化 → 代謝產(chǎn)物的改變 → 比較分析與正常人的代謝產(chǎn)物差異 → 發(fā)現(xiàn)和篩選出疾病新的生物標(biāo)記物 → 對(duì)相關(guān)疾病作出早期預(yù)警 → 發(fā)展新的有效的疾病診斷方法。 – 以藥物效應(yīng)及安全性為目標(biāo)，研究各種基因突變與藥效及安全性的關(guān)系，是研究高效、特效藥物的重要途徑，通過(guò)它為患者或者特定人群尋找合適的藥物。 轉(zhuǎn)錄組學(xué)： 研究全部 RNA的表達(dá)及功能 ? 轉(zhuǎn)錄組（ transcriptome） 指生命單元（通常是一種細(xì)胞）所能轉(zhuǎn)錄出來(lái)的所有 RNA——包括指導(dǎo)蛋白質(zhì)翻譯的 mRNA和非編碼 RNA (noncoding RNA, ncRNA)的總和。RNA研究相關(guān)技術(shù) RNA research related techniques and their application (進(jìn)展 ) 2023級(jí)碩士 徐文弟 2023年 9月 28日 導(dǎo)論 ? 再談中心法則 ? RNA世界 ? RNA生物學(xué)功能 ? RNA組學(xué) 再談中心法則 4 中心法則與 RNA 1961年 , 發(fā)現(xiàn) DNA依賴(lài)的 RNA聚合酶 1968年 , 提出 RNA是最早的信息分子 1982~1983年 , 發(fā)現(xiàn)核酶 1986年 , 提出“ RNA world” 1947年 , RNA第一次被描述 1968年 , 提出中心法則 中心法則與組學(xué) 基因組： 一種生物擁有的所有遺傳信息的總合 是一個(gè)細(xì)胞 （ 或病毒 ） 所承載的全部遺傳信息 ， 它代表了一種生物所具有的全部遺傳信息 。 比較基因組學(xué)（ parative genomics）： 基因組之間比較鑒定，研究生物進(jìn)化，預(yù)測(cè)新基因。 與蛋白質(zhì)組研究相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù) 疾病基因組學(xué)： 研究疾病相關(guān)基因、揭示疾病發(fā)病機(jī)制 ? 疾病基因組學(xué)研究的兩大任務(wù)： – 疾病基因或疾病相關(guān)基因 – 疾病易感性的遺傳學(xué)基礎(chǔ) 藥物基因組學(xué)： 研究遺傳變異對(duì)藥物效能和毒性的影響 藥物基因組學(xué)（ pharmacogenomics） – 是 功能基因組學(xué) 與 分子藥理學(xué) 的有機(jī)結(jié)合，它不是以發(fā)現(xiàn)人體基因組基因?yàn)橹饕康?，而是運(yùn)用已知的基因組學(xué)知識(shí)改善患者的治療。 （二）代謝組學(xué)的主要分析工具： 核磁共振、色譜及 MS ? 代謝組學(xué)研究側(cè)重于代謝物的組成、特性與變化規(guī)律，與生理學(xué)的聯(lián)系更加緊密。 ? 19821983年， Thomas Cech 和 Sidney Altman 等分別發(fā)現(xiàn) RNaseP的 RNA亞基和嗜熱四膜蟲(chóng)的前體 rRNA中的居間序列 (Intervening sequence． IVS)都具有酶的催化活性，它們是最早被發(fā)現(xiàn)的具有催化作用的 RNA分子 —— 核酶（ ribozyme），為 RNA轉(zhuǎn)錄后加工機(jī)制提供了新的認(rèn)識(shí)，并為生命起源的探討開(kāi)拓了新的境界。 ? RNA組學(xué)研究范疇（小分子 RNA） 包括： snRNA、 snoRNA、 scRNA、 催化性小 RNA（ small catalytic RNA） 、 小片段干涉 RNA（ small interfering RNA， siRNA） 、 微小 RNA（ microRNA， miRNA） Noncoding RNAs (ncRNAs) in eukaryotes Small RNA (sRNA) in bacteria Small nuclear RNAs (snRNAs) Small nucleolar RNAs (snoRNAs) MicroRNA(miRNA) Small temporal RNAs(stRNAs) Small interfering RNAs(siRNAs) RNA interference (RNAi) Guide RNAs(gRNAs) tRNA/mRNA: tmRNA 非編碼 RNA的名稱(chēng)與縮寫(xiě)符號(hào) RNA 研究的進(jìn)步 與 RNA 技術(shù)的發(fā)展密切相關(guān) RNA研究相關(guān)技術(shù) RNA研究相關(guān)技術(shù) RNA技術(shù)可以分為： RNA基礎(chǔ)研究相關(guān)的技術(shù) 、 RNA應(yīng)用相關(guān)的技術(shù) 、 RNA生物信息學(xué)技術(shù) . RNA基礎(chǔ)研究相關(guān)技術(shù)包括 RNA分離純化和鑒定技術(shù)、 RNA與其他生物大分子相互作用技術(shù)、 RNA高級(jí)結(jié)構(gòu)的研究技術(shù)和其他相關(guān) RNA技術(shù) 。 對(duì)于稀有樣本還聯(lián)合體外轉(zhuǎn)錄發(fā)展了 總 RNA擴(kuò)增技術(shù) (cRNA 擴(kuò)增 )。裂解不完全會(huì)降低最后得率，因?yàn)橐徊糠?RNA會(huì)殘留在未裂解的細(xì)胞中。已標(biāo)明 RNase free的塑料制品，如沒(méi)有開(kāi)封使用過(guò)，通常不必再處理 處理的步驟如下： 在玻璃燒