【正文】 改建適當(dāng)?shù)目寺≥d體后，下一步工作是如何將外源 DNA與載體 DNA連接在一起，即DNA的體外重組。有時(shí)所需用的兩種限制性內(nèi)切酶切割后形成非互補(bǔ)的粘性末端，此時(shí)需設(shè)法使之變成平端，如用 S1核酸酶消化或用 Klenow片段和 dNTP補(bǔ)平 3‘ 端，成為平末端。 TA克隆 TaqDNA聚合酶擴(kuò)增目的 DNA同時(shí)，在其末端加兩個(gè)游離的“ A” 只要載體切口處人工加上游離的“ T”，PCR產(chǎn)物即可與載體連接。 ? 對(duì)載體的復(fù)制擴(kuò)增無(wú)嚴(yán)格限制 。 另外還有 DEAE─ 葡聚糖轉(zhuǎn)化法等 。 感受態(tài)細(xì)胞 Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化（大腸桿菌，革蘭氏陽(yáng)性）1970年建立了此技術(shù)，其原理是與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，并發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞出現(xiàn)空隙，細(xì)菌這時(shí)的狀態(tài)就是感受態(tài)。 雙抗生素對(duì)照篩選 電泳篩選法 ? 直接提取重組 DNA進(jìn)行核酸凝膠電泳。 然后加入標(biāo)記的 DNA或 RNA探針進(jìn)行雜交。 ? 免疫學(xué)方法很多，如 Western blot，還有 免疫化學(xué)方法 、 酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定 （ enzyme linked immunosorbent assay， ELISA）、 放射免疫沉淀 、 免疫熒光抗體技術(shù) 等，可對(duì)目的基因表達(dá)的蛋白進(jìn)行定性，甚至定量檢測(cè)。 目前 ， DNA測(cè)序已高度自動(dòng)化 ， 所依賴的基本技術(shù)原理一是 Allan Maxam和 Walter Gilbert創(chuàng)建的化學(xué)裂解法 ， 二為 Frederick Sanger建立的雙脫氧末端終止法 。 謝謝觀看 /歡迎下載 BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES. BY FAITH I BY FAITH 。 端序列設(shè)計(jì)引物 ， 以提取的重組 DNA為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增 ， 看是否能擴(kuò)出目的基因片段 ， 進(jìn)而篩選陽(yáng)性克隆 。 同樣，凡是含有與探針互補(bǔ)序列的 DNA片段經(jīng)放射自顯影或顯色底物處理后，就會(huì)在 X光底片上出現(xiàn)雜交帶或在膜上顯色 斑點(diǎn)雜交（ Dot blot）與 Southern雜交的不同之處只在于被檢測(cè)的 DNA不經(jīng)電泳分離，直接點(diǎn)在 NC膜上用于雜交分析。 將轉(zhuǎn)化后得到的菌落或噬菌斑原位轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜（ nitrocellulose filter membrane， NC膜）上，得到一個(gè)與平板菌落或噬菌斑分布完全一致的復(fù)制品。用 插入失活 篩選的重組子載體往往帶有另一個(gè)抗生素抗性基因如 Ampr，因此可以通過(guò) 雙抗生素對(duì)照篩選 ，即陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子可以在含 Amp的培養(yǎng)板上生長(zhǎng)而不能在含 Tet的培養(yǎng)板上生長(zhǎng)。 例如用低溫 CaCl2（ 冰浴 ） 處理大腸桿菌 ，可以大大提高質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率 。 導(dǎo)入方法大致分為三類 ⑴ 化學(xué)方法： 如 CaCl2轉(zhuǎn)化法 、 磷酸鈣共沉淀法 。 ? ? 基因工程中的受體細(xì)胞又叫宿主細(xì)胞 ， 分為兩類： 原核細(xì)胞 （ 如大腸桿菌 、 枯草桿菌等 ） 和 真核細(xì)胞 （ 如酵母細(xì)胞 、 哺乳動(dòng)物細(xì)胞及昆蟲(chóng)細(xì)胞等 ） 。 通過(guò) PCR獲得粘末端 ? PCR技術(shù)的出現(xiàn)大大方便了基因的克隆 。一般采用 兩種限制酶 消化，由于粘性末端不同，載體分子和外源 DNA片段只能按一種方向形成重組分子，實(shí)現(xiàn) 定向克隆 定向克隆 連接效果與載體和 目的片段質(zhì)量有關(guān) 3： 1 10181。 所得到的目的基因無(wú)內(nèi)含子 、 無(wú)調(diào)控序列 ，而獲得連續(xù)編碼的序列 。 ? 利用該法合成的基因有：人生長(zhǎng)激素釋放抑制因子、胰島素原、腦啡肽及干擾素基因等。因此由這些高豐度 mRNA經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄得到與 mRNA互補(bǔ)的 cDNA（ plementary DNA，cDNA），可直接進(jìn)行克隆。 ? 不同細(xì)菌所包含的重組 DNA分子內(nèi)可能存在不同的染色體片段，這樣生長(zhǎng)的 全部細(xì)菌 所攜帶的各種染色體片段就代表了整個(gè)基因組DNA的所有序列。 ? 如 酵母人工染色體 （ yeast artificial chromosome，YAC） ， 這是由酵母染色體基因組的基本功能單位和 pBR322構(gòu)成的 ， 能自我復(fù)制的線性克隆載體 。 外源基因插入到兩個(gè)線狀粘粒之間 λ 噬菌體的 A蛋白切下 COS位點(diǎn)以外部分，中間部分包裝到外殼蛋白中，組成成熟的噬菌體顆粒。重組子大小在 75％－ 105％，可被包裝成為成熟顆粒。 因此可以從大腸桿菌培養(yǎng)基中分離 單鏈 DNA。 噬菌體載體 ? 是一種細(xì)菌病毒，可作為克隆載體。 質(zhì)粒帶有某些 遺傳信息 ，會(huì)賦予宿主細(xì)胞新的遺傳性狀，如質(zhì)粒攜帶的氨芐青霉素抗性基因使宿主細(xì)胞對(duì)氨芐青霉素產(chǎn)生抗性，從而輕易地篩選出成功轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒的細(xì)菌。 ④ 具有合適的篩選標(biāo)記 （ 如抗藥性基因 ， 酶基因等 ） ， 以便篩選陽(yáng)性克隆 。 逆轉(zhuǎn)錄酶 以 RNA為模板，合成 cDNA鏈（ 5’ →3 ’），另有 RNA酶 H活性。常用于 cDNA第一，二鏈的合成及反轉(zhuǎn)錄 PCR（ RTPCR）。磷酸基水解 。 常用的有 T4（ 噬菌體 ） DNA連接酶和 DNA連接酶 。其主要?jiǎng)儆猛荆? 改造及組建質(zhì)粒 組建基因組 DNA物理圖譜 基因組 DNA同源性研究 DNA重組克隆及亞克隆 DNA雜交與序列分析 注意事項(xiàng) 1. 酶切底物 DNA要純，抽提時(shí)酚／氯仿要去除干凈。 339。 ⑶ 從 339。 端突出的粘性末端 ， 如 EcoR I： 539。 Hpa I 539。 ? 例如 ， 從大腸桿菌 （ Escherichia Coli） RY13株中發(fā)現(xiàn)分離的第一種限制酶 ， 稱為 EcoR I。 一、分子克隆中常用的工具酶 ? 在重組 DNA與基因工程中 ， 對(duì)目的基因的分離 、 剪切和重組涉及到一系列酶催化反應(yīng) ，這些酶就像外科醫(yī)生的手術(shù)刀一樣 ， 是進(jìn)行基因工程操作必不可少的工具 。 ③ 將重組 DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)?受體細(xì)胞 （ 亦稱 宿主細(xì)胞 ） ，并與之一起增殖 。 基本概念 ? 這類克隆是在分子水平上操作 ， 故又稱 分子克?。?molecular cloning） 。分子克隆 （基因工程） 周坤福 13914739863 前言 ? 二十世紀(jì) 40年代，基因分子生物學(xué)家確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA，而不是蛋白質(zhì) 1944年 DNA ? 50年代， Waston和 Crick揭示了 DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)制 深刻意義在于： 解決了基因自我復(fù)制和遺傳信息的傳遞問(wèn)題 ? 50年代末和 60年代，相繼提出了“中心法則”和操縱子學(xué)說(shuō)，并成功破譯了遺傳密碼。 ? 在基因工程中所指的克隆 ， 是指在體外對(duì) DNA分子按照既定目的和方案進(jìn)行人工重組 ， 并將重組分子導(dǎo)入適合的宿主細(xì)胞 ， 使其在細(xì)胞中擴(kuò)增和繁殖 ， 以獲得該 DNA分子的大量拷貝 。 ② 在體外 ， 將目的基因片段連接到能自我復(fù)制的并且具有選擇標(biāo)記的 載體分子 上 ， 形成 重組 DNA分子 。 生物鋼 掃描電子顯微鏡下的蜘蛛單絲表面 掃描電子顯微鏡觀察下的蜘蛛單絲斷面 蜘蛛絲被拉斷時(shí)顯示出的 “皮 ”結(jié)構(gòu)， 也稱 鞘 結(jié)構(gòu)（箭頭所示部分） 蜘蛛絲被拉斷時(shí)顯示出的 芯 結(jié)構(gòu)，也稱 劍 結(jié)構(gòu)（箭頭所示部分） 目前世界范圍內(nèi)開(kāi)發(fā)的基因工程多肽藥物、疫苗、抗體有五百多種 理論意義 徹底填平了生物種屬間不可逾越的鴻溝 重組技術(shù)縮短了進(jìn)化單位 能按人們的意愿定向改造、培育新品種 解決醫(yī)學(xué)與生物學(xué)上長(zhǎng)期無(wú)法解決的許多重大（如是什么基因、在什么地方、什么時(shí)間、起什么作用？如何起作用？） 人們預(yù)言， 21世紀(jì)是生命科學(xué)的世紀(jì)，以基因工程為主導(dǎo)的生物技術(shù)可能對(duì)世界的重大問(wèn)題－－饑餓、疾病、能源、污染等提出切實(shí)的解決辦法，推動(dòng)社會(huì)生產(chǎn)力的飛速發(fā)展。 ? 第一個(gè)大寫(xiě)字母取自細(xì)菌 屬名 的