【文章內(nèi)容簡介】 ee的塑料制品，如沒有開封使用過，通常不必再處理 處理的步驟如下： 在玻璃燒杯中注入去離子水，加入 DEPC使其終濃度為%~%（ DEPCH2O）。（ DEPC二乙基焦碳酸酯為活性很強的劇毒物，須在通風櫥中小心使用） 將待處理的塑料制品放入一個可以高溫滅菌的容器中，注入DEPCH2O，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中，在通風柜中37℃ 或室溫下處理過夜 將 DEPCH2O小心倒入廢液瓶中，將裝有 DEPCH2O處理過的塑料制品的容器以鋁箔封口，高溫高壓蒸汽滅菌至少 30分鐘。 滅菌塑料制品烘烤干燥，置潔凈處備用 （ 2）玻璃和金屬物品 250℃ 烘烤 3小時以上 DEPC(二乙基焦碳酸酯 ) DEPC是 RNA酶的化學修飾劑 ,它和 RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)反應(yīng)而抑制酶活性 DEPC與氨水溶液混合會產(chǎn)生致癌物 ,因而使用時需小心 試驗所用試劑也可用 DEPC處理 ,加入 DEPC至 %濃度 ,然后劇烈振蕩 10分鐘 ,再煮沸 15分鐘或高壓滅菌以消除殘存的 DEPC,否則DEPC也能和腺嘌呤作用而破壞 mRNA活性 但 DEPC能與胺和巰基反應(yīng) ,因而含 Tris和 DTT的試劑不能用DEPC處理 實驗步驟 50~100mg的組織 ,加入 1mlTrizol試劑，用勻漿器打勻 (Trizol先放于冰上 ) 5min 200μl氯仿 ,劇烈震蕩混勻 30s，冰上靜置 3min ， 4℃ 離心 15min （取 400μl），加入等量體積的異丙醇，上下顛倒幾次混勻，室溫下放置 15min。（此步中注意：不要吸取任何中間層物質(zhì)，寧缺勿爛。） ， 4℃ 離心 15min ，防止 RNA沉淀丟失 70%乙醇（ DEPC處理的水配制）洗滌 1次，加 入 700μl乙醇，將 RNA沉淀彈起，漂洗。（此時 RNA是不溶解的） 9. 8000rpm，室溫離心 10min ，防止 RNA沉淀丟失 3~5分鐘，或放在室溫下使乙醇完全揮發(fā)掉 30μlDEPCH2O溶解。如發(fā)現(xiàn)沉淀難溶，68℃ 處理 10min (1)測定樣品在 260nm和 280nm的吸光值按 1OD=40μg/mlRNA計算 RNA的產(chǎn)量 OD260/OD280在 (2)進行甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳 ,確定 RNA的完整性和污染情況 RNA鑒定 RNA鑒定技術(shù)，主要是分析 RNA的量、大小、豐度、定位、剪切、修飾和序列等信息 純化的 RNA 可通過 光譜分析 和 定量 分析特定 RNA 大小最常用的技術(shù)是 Northern 雜交技術(shù)，它是由 Alwine等在 1977年建立的 ?核酸定量 （ DNA或 RNA的定量 ） A260 = 相當于 50μg/ml 雙鏈 DNA(dsDNA) 40μg/ml 單鏈 DNA (ssDNA or RNA) 20μg/ml 寡核苷酸 ?確定樣品中核酸的純度 純 DNA: A260/A280 = 純 RNA: A260/A280 = 核酸紫外吸收 衡量特異 mRNA豐度方法 經(jīng)典的衡量某一特異 mRNA豐度的方法的有：Northern 雜交 核糖核酸酶保護 定量的 反轉(zhuǎn)錄 PCR 等 為研究異質(zhì)細胞群中 RNA 和 DNA 序列的定位，還發(fā)展了 原位雜交術(shù) 目前這方面的技術(shù)發(fā)展方向是大規(guī)?；透咄浚渲?基因芯片 技術(shù)有著相當大的優(yōu)勢 RNA 加工修飾鑒定技術(shù) 有關(guān) RNA 加工修飾的鑒定技術(shù)有多種 其中利用 核酸酶對 RNA進行作圖 ， 定位內(nèi)含子和外顯子 ；通過核提取物 等進行 體外剪切分析 。 最近發(fā)展的 基因芯片技術(shù) 可以高通量地分析 RNA 剪接。 與 RNA 修飾和 RNA 編輯研究相關(guān)的技術(shù)主要有： snoRNA指導的 2‘ O核糖甲基化修飾鑒定技術(shù) 假尿苷化修飾鑒定技術(shù) mRNA的各種編輯鑒定技術(shù)等 另外，利用引物延伸法、 S1核酸酶法等可以進行RNA 末端鑒定。 近年來發(fā)展的 CAGE(cap analysis gene expression)，SAGE(serial analysis of gene expression)等技術(shù)可以實現(xiàn) RNA 末端大規(guī)模鑒定。 其基本原理是在 RNA 5‘ 端加上帶酶切位點的接頭，酶切后可產(chǎn)生帶有 5’ 端序列的短片段，經(jīng)過連接和測序，即可獲得大量 5‘ Tag 序列信息。通過分析 Taq 的頻率可同時估計基因的表達情況。 小 RNA豐度測定 隨著 siRNA、 microRNA、 snoRNA等非編碼 RNA 研究的不斷深入，小 RNA 的分析和鑒定技術(shù)也逐步完善。 目前有關(guān)小 RNA豐度測定主要是利用 改進反轉(zhuǎn)錄PCR 技術(shù) ，常見有三種方案： 一、在兩端加 RNA 接頭 二、通過在 3‘ 端加 polyA 尾模擬 mRNA 三、利用 stemloop 反轉(zhuǎn)錄引物技術(shù) 前兩者同樣可用于小 RNA 文庫的構(gòu)建，之后通過測序，可以獲得小 RNA 的序列信息，在大規(guī)模實驗的條件下，根據(jù)獲得的克隆頻數(shù)也能分析相應(yīng)的表達水平。 也有一小部分小 RNA序列是在生物信息學預測的結(jié)果基礎(chǔ)上進一步驗證獲得的。 目前，高通量小 RNA 分析鑒定技術(shù)常用的是 改進的非編碼 RNA芯片技術(shù) ；對于特定的小 RNA的分析鑒定除上述技術(shù)以外還有 改良的 Northern技術(shù) 等。 克隆 ncRNA的方法 計算機分析法 基因克隆法 蛋白質(zhì) RNA分離法 計算機分析法 大致過程 ： 利用計算機軟件從已知基因組序列中尋找基因間區(qū)中的 snoRNA序列，然后模擬其高級結(jié)構(gòu)，設(shè)計引物擴增其序列和克隆，或人工合成其序列，測定其功能。 小 RNA的克隆和鑒定 小鼠腦 組織勻漿 總 RNA 8%PAGE 回收 50110nt(fractionI)和 110500nt(fractionII) Poly(A)聚合酶加 C尾 cDNA pSPORT1 PCR 高密度陣列 雜交除去高豐度、已知的小 RNA 未雜交的 cDNA測序 詳見： 蛋白質(zhì) RNA復合物分離法 分離蛋白質(zhì) RNA復合物，除去蛋白質(zhì)，純化 RNA分子，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，克隆，測序，結(jié)果分析。 所得 RNA的 cDNA克隆必須進行 Northern雜交，以確認其轉(zhuǎn)錄物大小是否相符。 RNA與其他大分子相互作用研究技術(shù) RNA與蛋白相互作用在基因表達調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，相應(yīng)的技術(shù)也與細胞技術(shù)和蛋白質(zhì)技術(shù)交叉。 通過 光交聯(lián) 進行 RNA的體外修飾并增加 RNP的穩(wěn)定性，利用 凝膠阻滯 和 硝酸纖維素濾膜結(jié)合實驗 技術(shù)分析RNA 蛋白質(zhì)作用常數(shù)，用 免疫共沉淀 技術(shù)分離特異的RNP。 RNA 足跡 、 修飾干擾分析 和 RNP中寡核苷酸靶向的RNase H 切割 保護實驗 技術(shù)也常用于鑒定重要的蛋白質(zhì)結(jié)合位點。 目前這方面研究也有向大規(guī)模發(fā)展的趨勢，主要有兩種方案： 一是在細胞水平利用光交聯(lián)技術(shù)后，通過免疫共沉淀或者其他親和技術(shù)，獲取某個或某類蛋白的所有結(jié)合 RNA 基序，進一步通過分離純化和測序等，獲得 RNA與蛋白質(zhì)的相互作用信息。 反過來，利用標記的 RNA或者已知的 RNA結(jié)合蛋白也可獲得相應(yīng)與 RNA相互作用的蛋白或其他大分子，再通過蛋白質(zhì)組技術(shù)獲得相應(yīng)信息。 如 RNAi和 microRNA作用過程中許多新蛋白的發(fā)現(xiàn)就是通過這種技術(shù)完成的，從而逐步揭示了細胞內(nèi) RNA干擾的分子機制。 二是利用各種文庫篩選技術(shù)，如酵母三雜交技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、核糖體展示技術(shù)、抑制細菌轉(zhuǎn)錄終止檢測技術(shù)、 Northwestern 技術(shù)等篩選 RNA結(jié)合蛋白。 或反過來通過構(gòu)建天然或人工 RNA文庫篩選與蛋白質(zhì)特異結(jié)合的RNA 序列。 RNA與 DNA或 RNA的相互作用也是基因調(diào)控的重要方面 如 siRNA或 microRNA與靶 mRNA的結(jié)合，導致靶 mRNA 的降解或翻譯抑制；或者與靶 DNA結(jié)合指導 DNA的甲基化等。 從這也衍生出許多相關(guān)的實驗技術(shù)，例如 microRNA 的實驗性尋靶技術(shù) 。 RNA 高級結(jié)構(gòu)研究技術(shù) RNA 高級結(jié)構(gòu)、 RNA與其結(jié)合蛋白的高級結(jié)構(gòu)是RNA研究的重要組成部分。 RNA 在體內(nèi)是以 RNP 形式存在的，因此研究 RNP的結(jié)構(gòu)更具有意義。 與之相關(guān)技術(shù)有 各種顯微技術(shù) 、 X 光晶體衍射技術(shù) 和磁共振技術(shù) 等。 （高分辨率核糖體晶體結(jié)構(gòu)的解析、 Argonaute 蛋白晶體結(jié)構(gòu)的研究等都是這些技術(shù)發(fā)展的成果，并為 RNAi 機制的闡明起到巨大幫助。） 其他 RNA研究相關(guān)技術(shù) 在 RNA的研究中不可避免的會遇到 RNA降解問題，這就需要利用 RNA保存技術(shù) ，這是 RNA研究中最基礎(chǔ)也是最重要的技術(shù)之一。 各種 RNA工具酶 如 RNA聚合酶、 RNA酶、 RNA 連接酶和反轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)，使得進行 RNA 操作更加方便和容易，從而也促進 RNA 技術(shù)不斷創(chuàng)新，應(yīng)用范圍更加廣泛。 獲得已知序列的 RNA分子