【正文】 研究內(nèi)源性代謝物質(zhì)的動態(tài)變化 規(guī)律及與生物過程的聯(lián)系 ? 代謝組學(xué)分為 4個層次： ①代謝物靶標(biāo)分析（ metabolite target analysis） ②代謝譜分析（ metabolic profiling analysis） ③代謝組學(xué)（ metabonomics） ④代謝指紋分析（ metabolic fingerprinting analysis） ? 代謝組學(xué)研究對象： 生物體液 —— 血樣、尿樣等 完整的組織樣品、組織提取液和細(xì)胞培養(yǎng)液 （一）代謝組學(xué)的任務(wù)： 分析生物 /細(xì)胞代謝產(chǎn)物的全貌 主要的分析工具 ① 核磁共振 （ nuclear magic resonance， NMR）： 氫譜（ 1HNMR）、碳譜（ 13CNMR）及磷譜（ 31PNMR）。大量非編碼 RNA的發(fā)現(xiàn)及其生物學(xué)功能多樣性被揭示。 ? RNA的種類 、 大小和結(jié)構(gòu)遠(yuǎn)比 DNA表現(xiàn)出多樣性 。 1893 年， Kossel 提出，酵母來源的核酸含有核糖， RNA 的研究正式開始。 目前主要有兩種： 一是利用 電泳 根據(jù)分子大小分離； 二是利用不同濃度的 有機(jī)溶劑的沉降 或 吸附效率 不同分離。 ，因此制備 RNA時(shí)必須戴手套 2. RNase的又一污染源是取液器。（此時(shí) RNA是不溶解的） 9. 8000rpm，室溫離心 10min ，防止 RNA沉淀丟失 3~5分鐘，或放在室溫下使乙醇完全揮發(fā)掉 30μlDEPCH2O溶解。 目前有關(guān)小 RNA豐度測定主要是利用 改進(jìn)反轉(zhuǎn)錄PCR 技術(shù) ，常見有三種方案： 一、在兩端加 RNA 接頭 二、通過在 3‘ 端加 polyA 尾模擬 mRNA 三、利用 stemloop 反轉(zhuǎn)錄引物技術(shù) 前兩者同樣可用于小 RNA 文庫的構(gòu)建，之后通過測序，可以獲得小 RNA 的序列信息，在大規(guī)模實(shí)驗(yàn)的條件下，根據(jù)獲得的克隆頻數(shù)也能分析相應(yīng)的表達(dá)水平。 RNA 足跡 、 修飾干擾分析 和 RNP中寡核苷酸靶向的RNase H 切割 保護(hù)實(shí)驗(yàn) 技術(shù)也常用于鑒定重要的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。 RNA 高級結(jié)構(gòu)研究技術(shù) RNA 高級結(jié)構(gòu)、 RNA與其結(jié)合蛋白的高級結(jié)構(gòu)是RNA研究的重要組成部分。 直到 20世紀(jì) 80 年代末， 核酶專利 的出現(xiàn)使得 RNA 應(yīng)用技術(shù)的研究迅速升溫。 第一個反義核酸藥物 (VitravenekTM)已經(jīng)進(jìn)入商業(yè)市場，還有多種反義核酸進(jìn)入 III 期臨床試驗(yàn)。 脫氧核酶 (deoxyribozyme) 是近年來發(fā)現(xiàn)的一類具有催化活性的單鏈 DNA分子。 Aptamer一詞來源于拉丁文 Aptus，意即適合的意思 (fit)，而這種體外的篩選技術(shù)稱之為 指數(shù)級富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù) 即SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)。 篩選過程中，首先在一定的溫度下將寡核苷酸隨機(jī)序列庫與靶分子共同孵育于特定的緩沖液中，組合庫中的極少數(shù)分子將與靶分子結(jié)合，然后用物理的方法將結(jié)合的分子與末結(jié)合的分子分離開來。 直到 1998 年， Fire 和 Mello才首次揭示雙鏈 RNA能夠特異抑制具有相同序列的靶 mRNA 的表達(dá)，并將這一現(xiàn)象稱為 RNA 干涉(RNA interference， RNAi)。能高效阻斷某個特定基因的表達(dá) ,這項(xiàng)技術(shù)在疾病的 基因治療 上也有光明的應(yīng)用前景。 也有根據(jù)靶基因 mRNA設(shè)計(jì)的長 dsRNA經(jīng) Dicer 剪切成一系列 ~21nt 的 siRNA(統(tǒng)稱為 esiRNA)，能更有效、更方便地抑制基因的表達(dá)，但是其缺點(diǎn)是可能存在非特異效應(yīng)。 最近，有研究表明，通過與一些組織或細(xì)胞特異分子(如多肽、 aptamer 等 )聯(lián)用的修飾 siRNA 分子，可以使siRNA分子較有效地穿過細(xì)胞膜，甚至穿越血腦屏障，為該類藥物的實(shí)際應(yīng)用帶來了希望。 通過對已知非編碼 RNA基因的分析，統(tǒng)計(jì)歸納出一定地規(guī)律，是這些技術(shù)的常用手段。 目前人們已經(jīng)根據(jù)大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和經(jīng)驗(yàn)建立了多種比較成熟的設(shè)計(jì)軟件和工具，極大地促進(jìn)了這些核酸的有效利用，豐富了生物信息學(xué)的內(nèi)容。 RNA 技術(shù)不是孤立的，它與其他生物、化學(xué)、物理技術(shù)相互交叉。 3 RNA 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 RNA 功能的實(shí)現(xiàn)與其具有一定的空間結(jié)構(gòu)是分不開的，這正是 RNA 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的意義所在。 第三節(jié) 與 RNA相關(guān)的生物信息學(xué)技術(shù) 與 RNA相關(guān)的生物信息學(xué)技術(shù) 隨著生物信息學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，與 RNA 研究相關(guān)的各種數(shù)據(jù)庫、 RNA 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測、非編碼 RNA基因預(yù)測、 siRNA設(shè)計(jì)等生物信息學(xué)技術(shù)也逐漸完善。 基于 DNA 載體在體內(nèi)表達(dá) siRNA 的技術(shù)，其優(yōu)勢是可調(diào)控的表達(dá)，而且利用病毒載體可能更易在體內(nèi)獲得應(yīng)用；但是這種系統(tǒng)不可避免的與 miRNA機(jī)制相競爭，從而導(dǎo)致相當(dāng)大的非特異性和毒性。 共抑制現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn) ＲＮＡｉ研究的早期線索早在 20年前 ,來自于 美國和荷蘭的兩個轉(zhuǎn)基因植物實(shí)驗(yàn)組 Richjensen和同事 ,在對 矮牽牛 (petunias)進(jìn)行的研究中有個奇怪的發(fā)現(xiàn) :將一個能 產(chǎn)生色素的基因 置于一個強(qiáng)啟動子后 ,導(dǎo)入矮腳牽牛中 ,試圖加深花朵的紫顏色 ,結(jié)果沒看到期待中的深紫色花朵 ,多數(shù)花成了花斑的甚至白的 。 目前， RNAi 技術(shù)作為基因功能研究和疾病基因治療的革命性工具，已經(jīng)在醫(yī)藥開發(fā)、基因治療和功能基因組研究等方面得到廣泛應(yīng)用，并于 2023 年獲得諾貝爾獎。 SELEX技術(shù)原理 由于 aptamer 具有精確識別、易體外合成與修飾等特性， SELEX 技術(shù)在分析化學(xué)、基因調(diào)控、蛋白質(zhì)組研究、疾病治療與新藥研發(fā)等方面得到廣泛的應(yīng)用。從原始文庫中篩選配體相應(yīng)的 Aptamer的技術(shù)稱為 SELEX技術(shù)。 核酶類型 到目前為止，人們發(fā)現(xiàn)的核酶共有 6種類型： I類內(nèi)含子 RNaseP 錘頭狀核酶 發(fā)夾狀核酶 丁型肝炎核酶 VS核酶 通過對這 6類核酶組成及結(jié)構(gòu)的研究，人們利用錘頭狀、發(fā)夾狀、斧頭狀核酶的特點(diǎn)，人工合成所需要的核酶。核酶又稱核酸類酶、酶 RNA、類酶 RNA。 這方面技術(shù)也可大致分為兩大類： 用于生產(chǎn)其他產(chǎn)品的 RNA技術(shù) 直接用于藥物開發(fā)的 RNA 技術(shù)。 與之相關(guān)技術(shù)有 各種顯微技術(shù) 、 X 光晶體衍射技術(shù) 和磁共振技術(shù) 等。 反過來，利用標(biāo)記的 RNA或者已知的 RNA結(jié)合蛋白也可獲得相應(yīng)與 RNA相互作用的蛋白或其他大分子，再通過蛋白質(zhì)組技術(shù)獲得相應(yīng)信息。 目前，高通量小 RNA 分析鑒定技術(shù)常用的是 改進(jìn)的非編碼 RNA芯片技術(shù) ；對于特定的小 RNA的分析鑒定除上述技術(shù)以外還有 改良的 Northern技術(shù) 等。 最近發(fā)展的 基因芯片技術(shù) 可以高通量地分析 RNA 剪接。一般情況下采用以 DEPC配制的乙醇擦洗取 液器的內(nèi)部和外部，可基本達(dá)到要求 、玻璃和金屬物品的處理 （ 1）塑料制品：盡量使用一次性無菌塑料制品。 特點(diǎn)： 1. Trizol試劑含有苯酚，具有毒性和刺激性，注意操作 2. RNase污染的主要來源是操作過程中手和空氣中的浮沉，注意配帶手套，樣品盡可能蓋嚴(yán) 3. 細(xì)胞裂解必需充分且操作迅速。 Trizol的技術(shù)是目前應(yīng)用最廣泛和最著名的方法之一。 Resolution Science. 2023. 292:883896. Marat M. Yusupov,1* Gulnara Zh. Yusupova,1* Albion Bau,1 Kate Lieberman,1 Thomas N. Earnest,2 J. H. D. Cate,3 Harry F. Noller1 1 Center for Molecular Biology of RNA, Sinsheimer Laboratories, University of California at Santa Cruz, Santa Cruz, CA 95064, USA. 2 Berkeley Center for Structural Biology, Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA 94720, USA. 3 Whitehead Institute, Cambridge, MA 01242, USA. The Structural Basis of Ribosome Activity in Peptide Bond Synthesis Science. 2023. 289:920930. Poul Nissen,1* Jeffrey Hansen,1* Nenad Ban,1* Peter B. Moore,1, 2 Thomas A. Steitz1, 2, 3 1 Department of Molecular Biophysics and Biochemistry and 2 Department of Chemistry, Yale University, and 3 Howard Hughes Medical Institute, New Haven, CT 065208114, USA. * These authors contributed equally