【正文】 to this work. RNA組學 RNA組學研究全部非 mRNA小 RNA的集合 ? 人類基因組序列特點： 2萬 ? ， 與蛋白質合成有關的序列占整個基因組的 2%左右 ， 其余 98%的基因組序列沒有得到注釋 。 人們認識到 RNA的研究在 揭示生命本質 和 疾病防治 方面都有著不可或缺的意義。 ③ 色譜及聯(lián)用技術 ： 使樣品的分離、定性、定量一次完成，具有較高的靈敏度和選擇性。 蛋白質功能確定： 包括蛋白質定位研究，蛋白質活性，蛋白質相互作用，酶活性和確定酶底物，細胞因子的生物分析，配基 受體結合分析等。 功能基因組學（ functional genomics） : 分析鑒定基因組功能。 真核生物基因組是指一套完整單倍體 DNA（ 染色體 DNA） 及 線粒體 DNA或 葉綠體 DNA的全部序列 ， 既有編碼序列 ， 也有大量存在的非編碼序列 。 ? RNA功能基因組學 又稱 RNA組學（ RNomics）：是分析、鑒定非信使小 RNA（ small nonmessenger RNA, snmRNA）在特定狀態(tài)下表達差異、功能及其與蛋白質的相互作用。 – 使藥物治療模式：診斷定向治療 → 基因定向治療 。 ? 藥物代謝組學的研究，可闡明藥物在不同個體體內(nèi)的代謝途徑及其規(guī)律，將為合理用藥和個體化醫(yī)療提供重要依據(jù)。 “ RNA世界”目錄 The RNA World (Third Edition,2023) Raymond Thomas John Cold Spring Harbor Laboratory Press 一、起源于 RNA與 RNA起源 1. RNA的歷史、化學、地理生物學 2. 對 RNA世界起源認識的進展 3. 原始細胞：包含遺傳聚合體的膜囊泡 二、建立功能 RNA 4. 核糖開關與 RNA世界 5. 自我切割核酸酶的催化策略： RNA世界的遺跡？ 6. I 型內(nèi)含子如何起作用： RNA結構與功能的范例研究 三、退出古老的 RNA世界 —— 合成酶與核糖體 7. RNA、脂質、膜 8. 氨基酰 tRNA合酶 9. RNA在蛋白質合成中的作用 10. 從 RNA世界進化而來的核糖體與蛋白質翻譯 四、現(xiàn)代 RNA世界中豐富的 RNA角色 11. 核糖核蛋白世界 12. 不斷擴展的小核內(nèi)核糖核蛋白世界 13. 剪接體結構與功能 14. RNA分子位點特異性修飾的范例：尿嘧啶插入、缺失 RNA編輯 15. 端粒酶 RNA 16. 形狀多變的 mRNA：折疊的得與失 五、 RNA繼續(xù)戰(zhàn)勝 DNA 17. II型內(nèi)含子：一類剪接 RNA并入侵 DNA的核酶 18. SINE和 LINE：麻煩制造者、破壞者、先行者 19. 短 RNA生物學 20. 細菌內(nèi)小 RNA調(diào)控子的多能性 21. 參與哺乳動物基因劑量調(diào)控的長鏈非編碼 RNA 六、新興工具 22. RNA二級結構預測 23. 一種用于全原子 RNA建模的模塊層次方法 24. 功能 RNA序列的自動化體外篩選與芯片應用 25. 基于單分子方法的 RNA折疊、展開、動力學研究 RNA有何基本特點與功能？ ? RNA與蛋白質共同負責基因的表達和表達過程的調(diào)控 。 RNA的生物信息學技術則有各種數(shù)據(jù)庫、非編碼 RNA的預測、 RNA二級結構預測和各種設計軟件 . 第一節(jié) RNA基礎研究相關技術 RNA基礎研究相關技術 大致可分為四類： ? RNA分離純化 和 鑒定 技術、 ? RNA 與其他生物大分子 相互作用 技術、 ? RNA 高級結構 的研究技術 ? 其他 相關 RNA 技術。 這種體外轉錄體系是現(xiàn)代發(fā)展起來的體外轉錄 （ in vitro transcription） 技術 —— 在含有 RNA聚合酶 （ 轉錄酶 ） 、 必要的蛋白質因子 、 核苷三磷酸等條件的體外無細胞體系中 ，加入 DNA模板 ， 模仿體內(nèi)轉錄 、 生成 RNA的過程 。在清洗和裂解細胞時最好在低溫下操作，防止在操作過程中釋放的內(nèi)源 RNase降解了 RNA 4. 酵母和一些細菌由于細胞壁的特殊結構，可以加入 Trizol試劑同時加入無 RNase的玻璃珠并劇烈振蕩，使細胞裂解充分 5. 28℃ 避光保存一年 準備工作 RNA酶（ RNase）是導致 RNA降解最主要的物質。 滅菌塑料制品烘烤干燥，置潔凈處備用 （ 2）玻璃和金屬物品 250℃ 烘烤 3小時以上 DEPC(二乙基焦碳酸酯 ) DEPC是 RNA酶的化學修飾劑 ,它和 RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)反應而抑制酶活性 DEPC與氨水溶液混合會產(chǎn)生致癌物 ,因而使用時需小心 試驗所用試劑也可用 DEPC處理 ,加入 DEPC至 %濃度 ,然后劇烈振蕩 10分鐘 ,再煮沸 15分鐘或高壓滅菌以消除殘存的 DEPC,否則DEPC也能和腺嘌呤作用而破壞 mRNA活性 但 DEPC能與胺和巰基反應 ,因而含 Tris和 DTT的試劑不能用DEPC處理 實驗步驟 50~100mg的組織 ,加入 1mlTrizol試劑，用勻漿器打勻 (Trizol先放于冰上 ) 5min 200μl氯仿 ,劇烈震蕩混勻 30s，冰上靜置 3min ， 4℃ 離心 15min （取 400μl），加入等量體積的異丙醇，上下顛倒幾次混勻，室溫下放置 15min。 其基本原理是在 RNA 5‘ 端加上帶酶切位點的接頭，酶切后可產(chǎn)生帶有 5’ 端序列的短片段，經(jīng)過連接和測序，即可獲得大量 5‘ Tag 序列信息。 所得 RNA的 cDNA克隆必須進行 Northern雜交，以確認其轉錄物大小是否相符。 或反過來通過構建天然或人工 RNA文庫篩選與蛋白質特異結合的RNA 序列。 各種 RNA工具酶 如 RNA聚合酶、 RNA酶、 RNA 連接酶和反轉錄酶的發(fā)現(xiàn)，使得進行 RNA 操作更加方便和容易，從而也促進 RNA 技術不斷創(chuàng)新，應用范圍更加廣泛。 反義技術： 指根據(jù)堿基互補原理，用人工或生物體合成的特異互補的 DNA 或 RNA 片段 (或其化學修飾產(chǎn)物 ) 抑制或封閉目的基因表達 的技術。 與蛋白質酶相比，核酶的催化效率較低，是一種較為原始的催化酶。 切割發(fā)生在非配對的 3’側，切割產(chǎn)物 5’端是羥基。 SELEX過程中，首先是用組合化學合成 DNA的方法合成隨機序列的核酸庫，庫中的每一個成員是一個線形的寡聚物，庫中分子多樣性的程度取決于隨機寡核苷酸的長度。 各種改良 SELEX 技術： 自動化 SELEX 消減 SELEX (subtractive SELEX) 毛細管電泳 SELEX (CESELEX) 加尾 SELEX (tailored SELEX) 無引物基因組 SELEX(primerfree genomic SELEX) 切換 SELEX (toggling SELEX) 表達盒 SELEX(expression cassette SELEX) 變構篩選 (allosteric selection) 利用 SELEX 技術篩選獲得的針對 VEGF 的 RNA配基 (aptamer)已經(jīng)獲得美國 FDA批準上市，商品名為 Macugen，用于老年性視網(wǎng)膜黃斑營養(yǎng)不良 (AMD)的治療。 RNA干擾原理 RNAi－一種新的遺傳學研究工具 ? RNAi是植物、果蠅、線蟲和很可能包括哺乳動物在內(nèi)的許多生物 抵抗病毒感染 和 限制轉座子運動 的一種自然存在的防御機制。 基因沉默 ? 轉錄階段基因沉默 (transcriptional gene silencing ,or TGS)： 對于部分植物來說 ,轉基因引發(fā)的基因沉默可能是因為基因特異的甲基化而導致 ,這被稱為轉錄階段基因沉默 . ? 轉錄后發(fā)生的基因沉默 (post transcriptional gene silencing ,or PTGS)： Ｈａｍｉｌｔｏｎ等 ,率先在發(fā)生ＰＴＧＳ的西紅柿中檢測出與被沉默基因同源的約 25ｎｔ的短片段ＲＮＡ ,而未發(fā)生ＰＴＧＳ的西紅柿則不能檢出 25ｎｔ的ＲＮＡ ＨａｍｉｌｔｏｎＡＪｅｔａｌ . Ｓｃｉｅｎｃｅ ,1999,286(5441):950— 952 目前在體內(nèi)或體外 RNAi 中應用的 siRNA 主要有兩種來源：體外化學合成或轉錄的 siRNA和利用 DNA載體在細胞內(nèi)轉錄產(chǎn)生。也許今后針對體內(nèi)天然存在的具有 RNA干擾作用的 miRNA，設計特異調(diào)節(jié)該 miRNA表達水平的藥物是避免“ offtarget”作用的最佳選擇。 值得關注兩個 RNA 領域的重要網(wǎng)站： 英國的 Rfam網(wǎng)站； 德國的“ The RNA World website”網(wǎng)站 。然而其靶基因的實驗確定目前還非常困難， 通過生物信息學預測是確定 microRNA 靶基因的重要手段。 謝謝！ 謝謝觀看 /歡迎下載 BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES. BY FAITH I BY FAITH