【正文】 結(jié)語 RNA 研究的進步離不開 RNA 技術的發(fā)展 一般地講，新的理化技術的引進，可以使得 RNA 技術和 RNA 的研究產(chǎn)生革命性進步；然而，更多的是在已有技術的基礎上，通過 改變思路 和 技術整合 ，使已有的 RNA 技術得到進一步改良。 目前多種非編碼轉(zhuǎn)錄本的預測方法都有報道，如 tRNA 的預測 、snoRNA 的預測 、 microRNA 的預測 、 piRNA 的預測 等等，只是準確率還有待于進一步提高。 另外，各種導入方法的應用和改進，例如直接注射法、尾靜脈水動力注射法等，也取得較好效果，但是距離真正用于臨床還有相當長的路要走。 隨著 miRNA研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)根據(jù) miRNA設計的發(fā)夾 RNA，或基于 siRNA的發(fā)夾 RNA 在體內(nèi)都表現(xiàn)出有效地基因抑制作用。特別可以用于阻斷某些突變基因的表達 ,或者由蛋白過量表達引起的疾病。 在隨后的短短一年中， RNAi 現(xiàn)象被廣泛地發(fā)現(xiàn)存在于大多數(shù)真核生物中， RNAi 技術也被迅速應用到生命研究的各個領域。標準的方法是將蛋白靶分子固定于硝酸纖維素濾膜上，而其他小的靶分子則固定于固相載體的表面，因此，未與靶分子結(jié)合的序列很容易被沖洗掉，而與靶分子結(jié)合的序列將被分離出來并放大以獲得一個序列庫，再對這一序列庫進行下一輪的篩選和放大。 簡言之， Aptamer就是一段核酸序列，它能與相應的配體高特異性和高親合力地結(jié)合。脫氧核酶兼具 ASON 反義抑制作用和核酶的靶向性剪切活性等雙重優(yōu)勢，而且穩(wěn)定性較好。 核酶技術 幾乎在發(fā)現(xiàn)反義 RNA 的同時 , 人們發(fā)現(xiàn)了一類 具有酶活性的單鏈 RNA 分子 ，即核酶 (ribozyme) 1982 年， Cech 首先提出 Ribozyme 的概念，并認為核酶在生物體內(nèi)普通存在 核酶發(fā)現(xiàn)的意義： 改變了酶的化學本質(zhì)是蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)概念，揭示了RNA 在生物體內(nèi)的多功能特性， RNA 既是遺傳物質(zhì) , 還具有多功能的催化作用，是生命科學發(fā)展過程又一里程碑 83 一些內(nèi)含子 RNA具有自我剪接和催化功能 ? 由 RNA分子催化自身 內(nèi)含子剪接的反應稱 為 自我剪接 (selfsplicing) ? 自身剪接內(nèi)含子的 RNA具有催化功能，是一種 核酶 (ribozyme) 四膜蟲 rRNA的剪接 采用自我剪接方式 核酶（ ribozyme）是具有催化功能的 RNA分子。 從新 RNA應用技術的建立到專利出現(xiàn)的時間差也在不斷縮短。 RNA 在體內(nèi)是以 RNP 形式存在的，因此研究 RNP的結(jié)構(gòu)更具有意義。 目前這方面研究也有向大規(guī)模發(fā)展的趨勢，主要有兩種方案： 一是在細胞水平利用光交聯(lián)技術后，通過免疫共沉淀或者其他親和技術，獲取某個或某類蛋白的所有結(jié)合 RNA 基序，進一步通過分離純化和測序等，獲得 RNA與蛋白質(zhì)的相互作用信息。 也有一小部分小 RNA序列是在生物信息學預測的結(jié)果基礎上進一步驗證獲得的。如發(fā)現(xiàn)沉淀難溶，68℃ 處理 10min (1)測定樣品在 260nm和 280nm的吸光值按 1OD=40μg/mlRNA計算 RNA的產(chǎn)量 OD260/OD280在 (2)進行甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳 ,確定 RNA的完整性和污染情況 RNA鑒定 RNA鑒定技術，主要是分析 RNA的量、大小、豐度、定位、剪切、修飾和序列等信息 純化的 RNA 可通過 光譜分析 和 定量 分析特定 RNA 大小最常用的技術是 Northern 雜交技術，它是由 Alwine等在 1977年建立的 ?核酸定量 （ DNA或 RNA的定量 ） A260 = 相當于 50μg/ml 雙鏈 DNA(dsDNA) 40μg/ml 單鏈 DNA (ssDNA or RNA) 20μg/ml 寡核苷酸 ?確定樣品中核酸的純度 純 DNA: A260/A280 = 純 RNA: A260/A280 = 核酸紫外吸收 衡量特異 mRNA豐度方法 經(jīng)典的衡量某一特異 mRNA豐度的方法的有：Northern 雜交 核糖核酸酶保護 定量的 反轉(zhuǎn)錄 PCR 等 為研究異質(zhì)細胞群中 RNA 和 DNA 序列的定位，還發(fā)展了 原位雜交術 目前這方面的技術發(fā)展方向是大規(guī)模化和高通量，其中 基因芯片 技術有著相當大的優(yōu)勢 RNA 加工修飾鑒定技術 有關 RNA 加工修飾的鑒定技術有多種 其中利用 核酸酶對 RNA進行作圖 ， 定位內(nèi)含子和外顯子 ；通過核提取物 等進行 體外剪切分析 。根據(jù)取液器制造商的要求對取 液器進行處理。 Trizol技術 Trizol是一種新型總 RNA抽提試劑，內(nèi)含異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細胞，抑制細胞釋放出的核酸酶。） 現(xiàn)在各種材料的 RNA提取和純化均包括三個步驟： 破碎細胞釋放其內(nèi)含物、非 RNA 物質(zhì)的去除、 RNA 的濃縮。 RNA的基本特點 RNA生物學功能 ? 構(gòu)成核糖核蛋白體 ? 小核內(nèi)核糖核蛋白世界 ? 剪接體結(jié)構(gòu)與功能 ? RNA分子位點特異性修飾的范例：尿嘧啶插入、缺失 ? RNA編輯 ? 端粒酶 RNA ? 形狀多變的 mRNA：折疊的得與失 RNA的種類、分布、功能 核蛋白體 RNA信使 RNA轉(zhuǎn)運 RNA核內(nèi)不均一 RNA核內(nèi)小 RNA胞漿小 RNA 細胞核和胞液 線粒體 功 能rRNAmRN A mt rRNAtRNAmt mRN Amt tR NAHnRNASnRNASnoRNAscRN A/7SL RNA 核蛋白體組分蛋白質(zhì)合成模板轉(zhuǎn)運氨基酸成熟 mRN A 的前體參與 hnRNA 的剪接、轉(zhuǎn)運rRNA 的加工、修飾蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位合成的信號識別體的組分核仁小 RNA核蛋白體信使轉(zhuǎn)運核內(nèi)不均一核內(nèi)小胞漿小細胞核和胞液 線粒體 功 能核蛋白體組分蛋白質(zhì)合成模板轉(zhuǎn)運氨基酸成熟 的前體參與 的剪接、轉(zhuǎn)運的加工、修飾蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位合成的信號識別體的組分核仁小 Crystal Structure of the Ribosome at 197。 核酶的發(fā)現(xiàn)使得人們相信在生命的進化過程中曾經(jīng)存在著一個活躍 的 RNA世界 。 ② MS： MS按質(zhì)荷比（ m/z）進行各種代謝物的定性或定量分析，可得到相應的代謝產(chǎn)物譜。 翻譯后修飾的鑒定： 磷酸化、糖基化、酶原激活等過程。 研究內(nèi)容： 結(jié)構(gòu)基因組學（ structural genomics） : 遺傳圖譜、 物理圖譜、序列圖譜以及轉(zhuǎn)錄圖譜和大規(guī)模 DNA測序。 細菌基因組包含了 擬核 和 質(zhì)粒 中的 DNA序列 。 RNA組學： 研究全部非 mRNA小 RNA的集合 ? 人類基因組序列特點： 2萬 ? ， 與蛋白質(zhì)合成有關的序列占整個基因組的 2%左右 ， 其余 98%的基因組序列沒有得到注釋 。 腫瘤基因組解剖工程： 闡明腫瘤相關基因 基因激活和 /或失活及其復雜的相互作用是腫瘤發(fā)生的根本原因 癌癥基因組解剖計劃 （ Cancer Genome Anatomy Project， CGAP；又稱腫瘤 cDNA工程） ： – 擬逐步建立人類腫瘤細胞表達基因索引 – 發(fā)展快速分析腫瘤細胞的技術 – 獲知與腫瘤相關的基因、蛋白質(zhì)及其他生物標記物 – 建立腫瘤研究信息（數(shù)據(jù)與分析工具）、資源（克隆和文庫）及技術和方法學平臺 ? 代謝組學 （ metabonomics） 測定一個生物 /細胞中所有小分子（ Mr?1 000 ） 組成 ，描繪其 動態(tài)變化 規(guī)律，建立 系統(tǒng)代謝圖譜 ，并確定這些變化與生物過程的聯(lián)系。 （三）代謝組學： 是開展預測醫(yī)學和個體化醫(yī)學的重要手段 RNA世界 RNA 是一種可以作為信使、酶和結(jié)構(gòu)組分的多功能分子。 ? RNA通常以單鏈的形式存在 ， 但有復雜的局部二級結(jié)構(gòu)或三級結(jié)構(gòu) 。 RNA分離純化和鑒定技術 RNA分離純化和鑒定技術是幾乎所有 RNA基礎研究的基點。 利用真核細胞核抽提物 （ nuclear extract） 建立再造體系是當前生物技術商家提供體外轉(zhuǎn)錄商品試劑盒 （ kit） 的主要來源 。此酶非常穩(wěn)定，在一些極端的條件下只可暫時失活，但限制因素去除后又迅速恢復活性。（此步中注意：不要吸取任何中間層物質(zhì)，寧缺勿爛。通過分析 Taq 的頻率可同時估計基因的表達情況。 RNA與其他大分子相互作用研究技術 RNA與蛋白相互作用在基因表達調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，相應的技術也與細胞技術和蛋白質(zhì)技術交叉。 RNA與 DNA或 RNA的相互作用也是基因調(diào)控的重要方面 如 siRNA或 microRNA與靶 mRNA的結(jié)合，導致靶 mRNA 的降解或翻譯抑制；或者與靶 DNA結(jié)合指導 DNA的甲基化等。 獲得已知序列的 RNA分子 無論基礎或應用研究中，都有可能需要大量獲得已知序列的 RNA分子。 廣義地講，反義寡核苷酸技術、反義 RNA 技術、核酶技術、 RNAi 技術等都屬于反義技術范疇。 核酶技術原理： 核酶 RNA分子通過堿基配對原則與靶 mRNA 結(jié)合發(fā)揮酶活性，在特定的位點特異性滅活靶RNA 分子，同時兼具反義抑制效果。3`端是一個 2’ 3’環(huán)磷酸二酯，核酶催化水解底物需要被水解部有一個特殊的三聯(lián)密碼， NUX、 (N{G、 A． U； X