【正文】 RNA研究相關(guān)技術(shù) RNA research related techniques and their application (進(jìn)展 ) 2023級(jí)碩士 徐文弟 2023年 9月 28日 導(dǎo)論 ? 再談中心法則 ? RNA世界 ? RNA生物學(xué)功能 ? RNA組學(xué) 再談中心法則 4 中心法則與 RNA 1961年 , 發(fā)現(xiàn) DNA依賴的 RNA聚合酶 1968年 , 提出 RNA是最早的信息分子 1982~1983年 , 發(fā)現(xiàn)核酶 1986年 , 提出“ RNA world” 1947年 , RNA第一次被描述 1968年 , 提出中心法則 中心法則與組學(xué) 基因組： 一種生物擁有的所有遺傳信息的總合 是一個(gè)細(xì)胞 （ 或病毒 ） 所承載的全部遺傳信息 ， 它代表了一種生物所具有的全部遺傳信息 。 真核生物基因組是指一套完整單倍體 DNA（ 染色體 DNA） 及 線粒體 DNA或 葉綠體 DNA的全部序列 ， 既有編碼序列 ， 也有大量存在的非編碼序列 。 細(xì)菌基因組包含了 擬核 和 質(zhì)粒 中的 DNA序列 。 病毒基因組有的為 DNA（ DNA病毒 ） ， 有的則為 RNA（ RNA病毒 ） 。 * 基因組 （ genome） 基因組學(xué)： 包括結(jié)構(gòu)基因組學(xué)、功能基因組學(xué)和比較基因組學(xué) 基因組學(xué)（ genomics） 是闡明整個(gè)基因組的結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系以及基因之間相互作用的科學(xué)。 研究?jī)?nèi)容： 結(jié)構(gòu)基因組學(xué)（ structural genomics） : 遺傳圖譜、 物理圖譜、序列圖譜以及轉(zhuǎn)錄圖譜和大規(guī)模 DNA測(cè)序。 功能基因組學(xué)（ functional genomics） : 分析鑒定基因組功能。 比較基因組學(xué)（ parative genomics）： 基因組之間比較鑒定，研究生物進(jìn)化，預(yù)測(cè)新基因。 轉(zhuǎn)錄組學(xué)： 研究全部 RNA的表達(dá)及功能 ? 轉(zhuǎn)錄組（ transcriptome） 指生命單元（通常是一種細(xì)胞）所能轉(zhuǎn)錄出來的所有 RNA——包括指導(dǎo)蛋白質(zhì)翻譯的 mRNA和非編碼 RNA (noncoding RNA, ncRNA)的總和。 ? RNA功能基因組學(xué) 又稱 RNA組學(xué)（ RNomics）：是分析、鑒定非信使小 RNA（ small nonmessenger RNA, snmRNA）在特定狀態(tài)下表達(dá)差異、功能及其與蛋白質(zhì)的相互作用。 RNA組學(xué)： 研究全部非 mRNA小 RNA的集合 ? 人類基因組序列特點(diǎn)： 2萬 ? ， 與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的序列占整個(gè)基因組的 2%左右 ， 其余 98%的基因組序列沒有得到注釋 。 ? RNA組學(xué)研究范疇： 小分子 RNA，包括 snRNA、 snoRNA、 scRNA、 催化性小 RNA（ small catalytic RNA） 、 小片段干涉 RNA（ small interfering RNA， siRNA） 、 微小 RNA（ microRNA， miRNA） 以細(xì)胞、組織或機(jī)體在特定時(shí)間和空間上表達(dá)的 所有蛋白質(zhì) 即蛋白質(zhì)組（ proteome）為研究對(duì)象，分析細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì) 組成 、 表達(dá) 水平與 修飾 狀態(tài)；了解蛋白質(zhì)之間的 相互作用 與聯(lián)系；并在整體水平上研究蛋白質(zhì) 調(diào)控 的活動(dòng)規(guī)律，故又稱為 全景式蛋白質(zhì)表達(dá)譜（ global protein expression profile）分析 。 蛋白質(zhì)組學(xué)（ proteomics） 蛋白質(zhì)組： 全景式蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析 蛋白質(zhì)組學(xué)的中心任務(wù)： 研究細(xì)胞內(nèi)所有蛋白質(zhì)組成及其活動(dòng)規(guī)律 蛋白質(zhì)組學(xué)的研究?jī)?nèi)容： 一、蛋白質(zhì)組表達(dá)模式的研究，即結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)（ structural proteomics） 二、蛋白質(zhì)組功能模式的研究，即功能蛋白質(zhì)組學(xué)（ functional proteomics） 蛋白質(zhì)組學(xué)的主要任務(wù)： 蛋白質(zhì)鑒定： 可以利用一維電泳和二維電泳并結(jié)合生物質(zhì)譜、Western印跡、蛋白質(zhì)芯片等技術(shù)，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行全面的鑒定研究。 翻譯后修飾的鑒定： 磷酸化、糖基化、酶原激活等過程。 蛋白質(zhì)功能確定： 包括蛋白質(zhì)定位研究，蛋白質(zhì)活性，蛋白質(zhì)相互作用，酶活性和確定酶底物，細(xì)胞因子的生物分析，配基 受體結(jié)合分析等。 與蛋白質(zhì)組研究相關(guān)的數(shù)據(jù)庫 疾病基因組學(xué)： 研究疾病相關(guān)基因、揭示疾病發(fā)病機(jī)制 ? 疾病基因組學(xué)研究的兩大任務(wù)： – 疾病基因或疾病相關(guān)基因 – 疾病易感性的遺傳學(xué)基礎(chǔ) 藥物基因組學(xué)： 研究遺傳變異對(duì)藥物效能和毒性的影響 藥物基因組學(xué)（ pharmacogenomics） – 是 功能基因組學(xué) 與 分子藥理學(xué) 的有機(jī)結(jié)合，它不是以發(fā)現(xiàn)人體基因組基因?yàn)橹饕康?，而是運(yùn)用已知的基因組學(xué)知識(shí)改善患者的治療。 – 以藥物效應(yīng)及安全性為目標(biāo)，研究各種基因突變與藥效及安全性的關(guān)系，是研究高效、特效藥物的重要途徑，通過它為患者或者特定人群尋找合適的藥物。 – 使藥物治療模式：診斷定向治療 → 基因定向治療 。 腫瘤基因組解剖工程： 闡明腫瘤相關(guān)基因 基因激活和 /或失活及其復(fù)雜的相互作用是腫瘤發(fā)生的根本原因 癌癥基因組解剖計(jì)劃 （ Cancer Genome Anatomy Project， CGAP；又稱腫瘤 cDNA工程） ： – 擬逐步建立人類腫瘤細(xì)胞表達(dá)基因索引 – 發(fā)展快速分析腫瘤細(xì)胞的技術(shù) – 獲知與腫瘤相關(guān)的基因、蛋白質(zhì)及其他生物標(biāo)記物 – 建立腫瘤研究信息（數(shù)據(jù)與分析工具）、資源（克隆和文庫）及技術(shù)和方法學(xué)平臺(tái) ? 代謝組學(xué) （ metabonomics） 測(cè)定一個(gè)生物 /細(xì)胞中所有小分子（ Mr?1 000 ） 組成 ，描繪其 動(dòng)態(tài)變化 規(guī)律，建立 系統(tǒng)代謝圖譜 ，并確定這些變化與生物過程的聯(lián)系。 生命過程的表觀、生物化學(xué)的終極目標(biāo)。 代謝組學(xué)： 研究?jī)?nèi)源性代謝物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化 規(guī)律及與生物過程的聯(lián)系 ? 代謝組學(xué)分為 4個(gè)層次： ①代謝物靶標(biāo)分析（ metabolite target analysis） ②代謝譜分析（ metabolic profiling analysis） ③代謝組學(xué)（ metabonomics） ④代謝指紋分析（ metabolic fingerprinting analysis） ? 代謝組學(xué)研究對(duì)象： 生物體液 —— 血樣、尿樣等 完整的組織樣品、組織提取液和細(xì)胞培養(yǎng)液 （一）代謝組學(xué)的任務(wù)： 分析生物 /細(xì)胞代謝產(chǎn)物的全貌 主要的分析工具 ① 核磁共振 （ nuclear magic resonance， NMR）： 氫譜（ 1HNMR）、碳譜（ 13CNMR）及磷譜（ 31PNMR）。 ② MS： MS按質(zhì)荷比（ m/z）進(jìn)行各種代謝物的定性或定量分析，可得到相應(yīng)的代謝產(chǎn)物譜。 ③ 色譜及聯(lián)用技術(shù) ： 使樣品的分離、定性、定量一次完成，具有較高的靈敏度和選擇性。 （二）代謝組學(xué)的主要分析工具： 核磁共振、色譜及 MS ? 代謝組學(xué)研究側(cè)重于代謝物的組成、特性與變化規(guī)律，與生理學(xué)的聯(lián)系更加緊密。 ? 疾病 → 機(jī)體病理生理過程變化 → 代謝產(chǎn)物的改變 → 比較分析與正常人的代謝產(chǎn)物差異 → 發(fā)現(xiàn)和篩選出疾病新的生物標(biāo)記物 → 對(duì)相關(guān)疾病作出早期預(yù)警 → 發(fā)展新的有效的疾病診斷方法。 ? 藥物代謝組學(xué)的研究，可闡明藥物在不同個(gè)體體內(nèi)的代謝途徑及其規(guī)律，將為合理用藥和個(gè)體化醫(yī)療提供重要依據(jù)。 （三）代謝組學(xué)： 是開展預(yù)測(cè)醫(yī)學(xué)和個(gè)體化醫(yī)學(xué)的重要手段 RNA世界 RNA 是一種可以作為信使、酶和結(jié)構(gòu)組分的多功能分子。 RNA 與 DNA、蛋白質(zhì)，甚至 RNA本身都能發(fā)生相互作用，在生命活動(dòng)的各個(gè)環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要功能。大量非編碼 RNA的發(fā)現(xiàn)及其生物學(xué)功能多樣性被揭示。 核酶的發(fā)現(xiàn)使得人們相信在生命的進(jìn)化過程中曾經(jīng)存在著一個(gè)活躍 的 RNA世界 。 人們認(rèn)識(shí)到 RNA的研究在 揭示生命本質(zhì) 和 疾病防治 方面都有著不可或缺的意義。 ? 19821983年， Thomas Cech 和 Sidney Altman 等分別發(fā)現(xiàn) RNaseP的 RNA亞基和嗜熱四膜蟲的前體 rRNA中的居間序列 (Intervening sequence． IVS)都具有酶的催化活性，它們是最早被發(fā)現(xiàn)的具有催化作用的 RNA分子 —— 核酶（ ribozyme），為 RNA轉(zhuǎn)錄后加工機(jī)制提供了新的認(rèn)識(shí)，并為生命起源的探討開拓了新的境界。 ? 1986年， Walter Gilbert 創(chuàng)造了“ RNA world”這個(gè)名詞，用于描述其提出的關(guān)于分子起源的假說：在生命進(jìn)化的早期存在一個(gè)只有 RNA，沒有 DNA和蛋白質(zhì)的世界； RNA既是遺傳信息載體又具有酶的催化功能，它們催化自身的合成。 “ RNA世界”目錄 The RNA World (Third Edition,2023) Raymond Thomas John Cold Spring Harbor Laboratory Press 一、起源于 RNA與 RNA起源 1. RNA的歷史、化學(xué)、地理生物學(xué) 2. 對(duì) RNA世界起源認(rèn)識(shí)的進(jìn)展 3. 原始細(xì)胞：包含遺傳聚合體的膜囊泡 二、建立功能 RNA 4. 核糖開關(guān)與 RNA世界 5. 自我切割核酸酶的催化策略： RNA世界的遺跡？ 6. I 型內(nèi)含子如何起作用： RNA結(jié)構(gòu)與功能的范例研究 三、退出古老的 RNA世界 —— 合成酶與核糖體 7. RNA、脂質(zhì)、膜 8. 氨基酰 tRNA合酶 9. RNA在蛋白質(zhì)合成中的作用 10. 從 RNA世界進(jìn)化而來的核糖體與